8: Основні прийоми
- Page ID
- 2597
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
Середовище клітини дуже складне, що ускладнює вивчення окремих реакцій, ферментів або шляхів in situ. Традиційний підхід, який використовують біохіміки для вивчення цих речей, полягає у виділенні молекул, ферментів, ДНК, РНК та інших цікавих предметів, щоб їх можна було аналізувати незалежно від мільйонів інших процесів, що відбуваються одночасно. Сьогодні ці підходи використовуються пліч-о-пліч з новими методами, які дозволяють зрозуміти події всередині клітин в більшому масштабі - наприклад, визначаючи всі гени, які експресуються в даний момент часу в конкретних клітині. У цьому розділі ми коротко розглянемо деякі часто використовувані методи, що використовуються для вивчення біологічних молекул та їх взаємодій.
- 8.1: Лізис клітин
- Щоб відокремити сполуки від клітинних середовищ, потрібно спочатку розбити (лізувати) клітини. Клітини розбиваються відкритими, в буферизованих розчинами, для отримання лізату. Існує кілька способів досягнення цього.
- 8.2: Методи фракціонування та хроматографії
- Фракціонування зразків, як випливає з назви, - це процес виділення компонентів або фракцій лізату. Фракціонування зазвичай починається з центрифугування лізату. Використовуючи низькошвидкісне центрифугування, можна видалити залишки клітин, залишаючи супернатант, що містить вміст клітини. Використовуючи послідовно вищі швидкості центрифугування (і результуючі g сили) можна відокремити від цитоплазми різні клітинні компоненти, такі як ядра, мітохондрії тощо.
- 8.3: Електрофорез
- Електрофорез використовує електричне поле, нанесене на гелеву матрицю, щоб відокремити великі молекули, такі як ДНК, РНК та білки, за зарядом та розміром. Зразки завантажуються в лунки гелевої матриці, яка може розділяти молекули за розмірами, і поперек гелю наноситься електричне поле. Це поле змушує негативно заряджені молекули рухатися до позитивного електрода. Гелева матриця, сама по собі, діє як сито, через яке швидко проходять найдрібніші молекули, в той час як більш довгі молекули повільнішими
- 8.4: Виявлення, ідентифікація та кількісне визначення специфічних нуклеїнових кислот та білків
- Один із способів виявлення наявності певної нуклеїнової кислоти або білка залежить від перенесення відокремлених молекул з гелів на мембрану, виготовлену з нітроцелюлози або нейлону, щоб створити «пляму» та зондування для молекул (ів), що цікавлять, використовуючи реагенти, які спеціально зв'язуються з цими молекулами. У наступному розділі буде розглянуто, як це можна зробити для нуклеїнових кислот, а також для білків.
- 8.5: Транскриптоміка
- Розглянемо матрицю, що містить всі відомі послідовності генів в геномі. Щоб зробити таку матрицю для аналізу, потрібно зробити копії кожного гена, або шляхом хімічного синтезу, або за допомогою ПЛР. Потім нитки отриманих ДНК будуть розділені, щоб отримати одножильні послідовності, які можна було б прикріпити до чіпа. Кожна скринька сітки буде містити послідовність з одного гена. Можна було б проаналізувати транскриптом - всі мРНК, що виробляються у вибраних клітині в даний момент часу.
- 8.6: Виділення генів
- Методи виділення генів були недоступні до 1970-х років, коли відкриття рестрикційних ферментів і винахід молекулярного клонування вперше надали способи отримання великої кількості специфічних фрагментів ДНК для дослідження. Хоча для отримання великої кількості певного фрагмента ДНК молекулярне клонування значною мірою замінено прямою ампліфікацією за допомогою описаної пізніше полімеразної ланцюгової реакції, клоновані ДНК все ще дуже корисні з різних причин.
- 8.7: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
- Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) дозволяє використовувати силу реплікації ДНК для надзвичайно ампліфікації ДНК за короткий проміжок часу. Як відомо, клітини відтворюють свою ДНК до того, як вони поділяються, і при цьому подвоюють кількість ДНК клітини. ПЛР по суті імітує клітинну реплікацію ДНК в пробірці, багаторазово копіюючи цільову ДНК знову і знову, щоб виробляти велику кількість бажаної ДНК.
- 8.8: Зворотна транскрипція
- У центральній догмі використовуються коди ДНК на мРНК, які кодують білок. Одне відоме виключення з центральної догми виставляють ретровіруси. Ці віруси, кодовані РНК-кодуванням, мають фазу свого життєвого циклу, в якій їх геномна РНК перетворюється назад в ДНК вірусно закодованим ферментом, відомим як зворотна транскриптаза. Здатність перетворювати РНК в ДНК - метод, який бажаний в лабораторії з численних причин.
- 8.9: ЛАД
- Методика передачі енергії флуоресцентного резонансу (FRET) заснована на спостереженні, що молекула, збуджена поглинанням світла, може передавати енергію сусідній молекулі, якщо спектр випромінювання першої молекули перекривається зі спектром збудження другої. Ця передача енергії може відбуватися лише в тому випадку, якщо дві молекули знаходяться досить близько один від одного (не більше декількох нанометрів один від одного).
- 8.10: Редагування геному (CRISPR)
- Розробка інструментів, які дозволили б вченим внести конкретні, цілеспрямовані зміни в геномі, був Святий Грааль молекулярної біології. Геніальний новий інструмент, який є простим та ефективним у внесенні точних змін, готовий революціонізувати поле, як це робила ПЛР у 1980-х роках. Відомий як система CRISPR/Cas9 і часто скорочується просто як CRISPR, він заснований на своєрідній бактеріальної імунної системи, яка дозволяє бактеріям розпізнавати та інактивувати вірусних загарбників.
- 8.11: Розщеплення білка
- Через їх великих розмірів інтактні білки можуть бути важко вивчені за допомогою аналітичних методів, таких як мас-спектрометрія. Отже, часто бажано розбити великий поліпептид вниз на більш дрібні шматочки. Протеази - це ферменти, які зазвичай розривають пептидні зв'язки шляхом зв'язування з конкретними амінокислотними послідовностями в білку та каталізуючи їх гідроліз.
- 8.12: Мембранна динаміка (FRAP)
- Розуміння динаміки руху в мембранах клітин є провінцією методики відновлення флуоресценції після фотовідбілювання (FRAP). Цей оптичний метод використовується для вимірювання двовимірної бічної дифузії молекул у тонких плівках, таких як мембрани, за допомогою флуоресцентно маркованих зондів. Він також має застосування в зв'язуванні білка.
Мініатюра: Західна пляма. Зображення використовується з дозволу (CC BY-SA 3.0; Магнус Манске).