Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

8.8: Зворотна транскрипція

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    2629

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    У центральній догмі використовуються коди ДНК на мРНК, які кодують білок. Одне відоме виключення з центральної догми виставляють ретровіруси. Ці віруси, кодовані РНК-кодуванням, мають фазу свого життєвого циклу, в якій їх геномна РНК перетворюється назад в ДНК вірусно закодованим ферментом, відомим як зворотна транскриптаза. Здатність перетворювати РНК в ДНК - метод, який бажаний в лабораторії з численних причин. Наприклад, перетворення РНК, що цікавлять, в кДНК використовується в RT-PCR, а також в інших додатках, таких як аналіз мікромасивів.

    Процес

    По-перше, створюється олігонуклеотид ДНК, який служить ґрунтовкою для зворотної транскриптази для використання на цільовій РНК. Грунтовка, звичайно, повинна доповнювати сегмент (біля 3' кінця) РНК, який потрібно посилити. РНК, зворотна транскриптаза, праймер і чотири DNTP змішуються. При одному раунді реплікації РНК перетворюється в одну нитку ДНК. Денатурація звільняє однониткову кДНК, яка може бути використана як є, або перетворена в дволанцюгову кДНК, залежно від застосування.


    Малюнок 8.37 - Зворотна транскриптаза ВІЛ. Функція нуклеази потрібна для життєвого циклу вірусу, але не для лабораторного використання. Вікіпедія


    Виявлення молекулярних взаємодій

    Вивчення біохімії - це в основному вивчення взаємодій клітинних молекул. Методи виявлення взаємодій між біомолекулами, з цієї причини, дуже корисні біохімікам. Зараз ми обговоримо пару дуже різних методів виявлення цих міжмолекулярних взаємодій.

    Дріжджі двогібридні системи (Y2H)

    Малюнок 8.38 - Структура еукаріотичного транскрипційного активатора, що показує ДНК-зв'язуючий домен (ДБД) і домен транскрипційної активації (TAD). Вікіпедія

    Дріжджі два гібридних скринінг є складною технікою для визначення того, який білок (s), з колекції всіх білків клітини, взаємодіє з конкретним білком, що цікавить. Метод спирається на взаємодію між двома білками для відновлення функціонального активатора транскрипції всередині дріжджових клітин. Ви можете пам'ятати, що багато активатори транскрипції - це модульні білки, які мають домен, який зв'язується з ДНК, і інший домен, який активує транскрипцію (рис. 8.38).

    Якщо фактор транскрипції розщеплений, так що зв'язуючий домен прикріплений до одного білка, а домен активації до іншого білка, функціональний транскрипційний активатор може бути заново створений тільки в тому випадку, якщо два «несучих» білка потрапляють в безпосередній близькості - тобто взаємодіють. Наявність цього функціонального активатора можна виявити за експресією репортерного гена.

    Простий спосіб зрозуміти цю ідею - думати про активатор транскрипції як пристрій, як ліхтарик, який має дві частини, акумулятор та лампу, які повинні бути разом, щоб функціонувати. Ні людина, у якого є просто акумулятор, ні той, у кого є тільки лампа, не зможуть побачити в темній кімнаті. Але якщо вони взаємодіють, підійшовши досить близько, щоб вставити акумулятор у ліхтар, їх взаємодія може бути виявлена тим, що ліхтар тепер буде функціональним, про що свідчить вироблене світло.

    Це займе два танго

    На малюнку 8.39 (A) показаний нормальний активатор транскрипції дріжджів GAL4 як з ДНК-зв'язуванням (DBD), так і з доменами активації (AD). Він здатний стимулювати транскрипцію гена репортера нижче за течією, лак z. панелі B і C показують конструкції, які виробляють GAL4 DBD і AD, відповідно, злиті з іншими білками, один з яких називається «приманка», а інший як «здобич». Жоден з цих злитих білків не може стимулювати транскрипцію гена lac z. Коли конструкції кодують як приманку, так і видобуток знаходяться в одній дріжджовій клітині, якщо білок приманки взаємодіє з здобиччю, DBD і AD GAL4 будуть об'єднані, щоб відновити функціональний GAL4. Наявність функціонального GAL4 легко виявити, оскільки це стимулюватиме експресію гена lac z reporter. Якщо білки приманки і видобутку не взаємодіють, то не буде вираження лаку з. Коли взаємодія виявляється через експресію гена-репортера, потім можна ідентифікувати специфічний білок видобутку.

    Дріжджова двогібридна система дозволяє проводити одночасний скринінг багатьох білків видобутку шляхом побудови великих колекцій злитих конструкцій, при цьому кожен потенційний білковий партнер білка приманки зливається до домену активації GAL4.


    Малюнок 8.39 - Чотири сценарії для дріжджової двогібридної системи. UAS = Послідовності активатора Upstream - діє як промоутер. Сценарій А показує, що два фактори транскрипції починаються як один білок. Вікіпедія