Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

8.4: Виявлення, ідентифікація та кількісне визначення специфічних нуклеїнових кислот та білків

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    2612

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Хоча гелевий електрофорез може використовуватися для розчинення молекул у суміші, сама по собі методика не дозволяє виявляти та ідентифікувати конкретні послідовності нуклеїнових кислот або білків. Наприклад, показаний вище 2-D гель чітко розділяє велику кількість білків у зразку на окремі плями. Однак якби ми хотіли дізнатися, чи присутній конкретний білок, ми не могли б сказати, просто подивившись на гель. Так само в агарозному гелі, хоча смугам ДНК можна було б присвоїти розмір, не можна було розрізнити два ДНК різної послідовності, якби вони були однакової довжини в парах основи. Один із способів виявлення наявності певної нуклеїнової кислоти або білка залежить від перенесення відокремлених молекул з гелів на мембрану, виготовлену з нітроцелюлози або нейлону, щоб створити «пляму» та зондування для молекул (ів), що цікавлять, використовуючи реагенти, які спеціально зв'язуються з цими молекулами. У наступному розділі буде розглянуто, як це можна зробити для нуклеїнових кислот, а також для білків.

    Південні і північні плями

    Південний пляма названий на честь свого винахідника, професора Оксфорда Едвіна Саутерна, який придумав протокол перенесення фрагментів ДНК з гелю на нітроцелюлозний лист і виявлення певної послідовності ДНК серед смуг на плямі. Як показано на малюнку 8.21, метод працює наступним чином. Суміш молекул ДНК (часто ДНК, яка була розрізана на більш дрібні фрагменти за допомогою рестрикційних ендонуклеаз) завантажується на агарозний гель, як зазвичай. Після завершення роботи гелю смуги ДНК переносяться з гелю на мембрану. Це може бути досягнуто шляхом капілярного перенесення, де гель поміщається в контакт з шматком мембрани і буфер витягується через гель шляхом вбирання його в стопку абсорбуючої паперу, розміщеної над мембраною. У міру переміщення буфера він несе з собою фрагменти ДНК. ДНК зв'язується з мембраною, залишаючи «відбиток» фрагментів ДНК, який точно відображає їх положення в гелі. Промокальна мембрана може бути оброблена ультрафіолетовим світлом, теплом або хімічними речовинами, щоб міцно прикріпити ДНК до мембрани.

    Далі до мембрани додається зонд, або візуалізуючий агент, специфічний для цікавить молекули. На малюнку 8.21 це називається маркованим зондом. Зонди в південній плямі - це шматочки ДНК, розроблені таким чином, щоб доповнювати бажану цільову послідовність. Якщо на плямі присутній цікавить послідовність, то зонд, який доповнює його, може базу-пара (гібридизувати) з нею. Потім пляму промивають, щоб видалити весь незв'язаний зонд. Зонди маркуються радіоактивністю або іншими хімічними реагентами, які дозволяють їх легко виявити при зв'язуванні з плямою, тому можна візуально визначити, чи зв'язався зонд з будь-якою з смуг ДНК на плямі. Враховуючи, що Південний блот спирається на специфічне сполучення основи між зондом та цільовою послідовністю, легко адаптувати техніку для виявлення конкретних молекул РНК, а також. Модифікацію цього методу для виявлення РНК жартома назвали «північним» плямом.


    Малюнок 8.21 - схема північного або південного порідка. Південне промокання додає денатурацію пасма між кроками 4 і 5. Вікіпедія

    Вестерн Плями

    Білки, зі зрозумілих причин, не можуть бути виявлені за допомогою сполучення з ДНК зондом, але білкові плями, зроблені шляхом перенесення білків, відокремлених на гелі, на мембрану, можуть бути прощупані за допомогою специфічних антитіл проти конкретного білка, що цікавить. При виявленні білка зазвичай використовуються два антитіла, перше з яких не маркується. Етикетка знаходиться на другому антитілі, яке покликане розпізнавати лише перше антитіло в режимі «piggyback». Перше антитіло специфічно зв'язується з білком, що цікавить на плямі, а друге антитіло розпізнає і зв'язує перше антитіло. Друге антитіло зазвичай несе фермент або реагент, який може викликати реакцію на отримання кольору при подальшому лікуванні. Зрештою, якщо цікавить молекула виявиться в вихідній суміші, вона «засвітиться» і розкриється на плямі. Цю варіацію на тему блоттинга охрестили західним плямом (рис. 8.22).


    Малюнок 8.22 - Результат аналізу вестерн-блот. Вікіпедія

    У кожному з описаних вище плям зв'язування зонда з молекулою мішені дозволяє визначити, чи була в зразку цільова послідовність або білок. Хоча плями призначені для використання для виявлення, а не для точного кількісного визначення, можна отримати оцінки достатку молекули-мішені з денситометричних вимірювань інтенсивності сигналу.

    Мікромасиви

    2-D гелі - це спосіб обстеження широкого спектру білкових молекул одночасно. Один підхід до створення чогось подібного з ДНК або РНК включає те, що називаються мікромасивами. Мікромасиви особливо корисні для моніторингу виразів тисяч генів одночасно. Там, де північна пляма дозволила б ідентифікувати одну мРНК із суміші мРНК, експеримент з мікромасивом може дозволити одночасну ідентифікацію тисяч мРНК, які можуть бути зроблені клітиною в даний час. Також можна виконати кількісне визначення набагато надійніше, ніж з плямою.

    Мікромасиви використовують скляний слайд, або чіп, до якого прикріплені короткі послідовності одноцепочечной ДНК, розташовані в сітці, або матриці (рис. 8.23) Кожній позиції в сітці відповідає унікальний ген. Тобто послідовність ДНК на цьому місці є частиною послідовності конкретного гена. Кожна пляма на сітці має кілька однакових копій однієї послідовності. Реєструється послідовність генів, іммобілізована в кожній позиції сітки.


    Малюнок 8.23 - Конструкція мікромасиву. Зображення Таралин Тан

    До слайду додаються суміші молекул зразка, деякі з яких будуть розпізнавати і зв'язуватися конкретно з послідовностями на слайді. Зв'язування між молекулами зразка та послідовностями, прикріпленими до слайда, відбувається шляхом сполучення основи, у випадку мікромасивів ДНК. Потім слайд промивають, щоб видалити молекули зразка, які спеціально не пов'язані з послідовностями в сітці.

    Молекули зразка позначені флуоресцентним барвником, що дозволяє ідентифікувати плями, де вони зв'язуються. Сітка аналізується пляма за плямою для зв'язування молекул зразка з іммобілізованими послідовностями. Чим більше молекул зразка пов'язані на місці, тим більша інтенсивність флуоресценції барвника, яка буде спостерігатися. Інформація з цього аналізу може дати інформацію про наявність/відсутність/достатку молекул в зразку, які зв'язуються з послідовностями в сітці.


    Малюнок 8.24 - Широкомасштабний аналіз мікромасиву транскриптом миші. Вікіпедія