Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

8.7: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    2620

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Молекулярне клонування було першим методом, доступним для виділення цікавого гена та створення багатьох його копій для отримання достатньої кількості ДНК для дослідження. Сьогодні існує більш швидкий і простий спосіб отримання великої кількості цікавить послідовності ДНК -полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). ПЛР дозволяє використовувати силу реплікації ДНК для надзвичайно ампліфікації ДНК за короткий проміжок часу. Як відомо, клітини відтворюють свою ДНК до того, як вони поділяються, і при цьому подвоюють кількість ДНК клітини. ПЛР по суті імітує клітинну реплікацію ДНК в пробірці, багаторазово копіюючи цільову ДНК знову і знову, щоб виробляти велику кількість бажаної ДНК.

    Вибіркова реплікація

    На відміну від клітинної реплікації ДНК, яка підсилює всю ДНК клітини під час циклу реплікації, ПЛР робить цілеспрямовану ампліфікацію для реплікації лише сегмента ДНК, обмеженого двома праймерами, які визначають, де починається реплікація ДНК-полімерази. Малюнок 8.34 ілюструє процес. Кожен цикл ПЛР включає в себе три етапи, денатурування, відпал і подовження, кожен з яких відбувається при різній температурі.

    Малюнок 8.34 - Етапи в полімеразної ланцюгової реакції. Зображення Алеї Кім

    Вихідні матеріали

    Оскільки ПЛР - це, в основному, реплікація ДНК в пробірці, потрібні всі звичайні інгредієнти, необхідні для реплікації ДНК:

    • Шаблон (ДНК, що містить цільову послідовність, яка копіюється)
    • Праймери (для ініціювання синтезу нових ниток ДНК)
    • Термостабільна ДНК-полімераза (для проведення синтезу). Полімераза повинна бути термостабільною, оскільки тепло використовується для поділу шаблонів ДНК ниток у кожному циклі.
    • DNTP (нуклеотиди ДНК для побудови нових ниток ДНК).
    • Шаблон - це ДНК, яка містить ціль, яку ви хочете ампліфікувати («мішень» - це конкретна область ДНК, яку ви хочете ампліфікувати).

    Праймери - це короткі синтетичні однониткові молекули ДНК, послідовність яких відповідає області, що фланкує цільову послідовність. Можна хімічно синтезувати молекули ДНК будь-якої заданої базової послідовності, використовувати в якості праймерів. Щоб зробити праймери правильної послідовності, яка буде зв'язуватися з шаблоном ДНК, необхідно трохи знати послідовність шаблонів по обидва боки області ДНК, що підлягає ампліфікації. ДНК-полімерази та DNTP комерційно доступні від компаній, що постачають біотехнології.

    Малюнок 8.35 - ПЛР-пробірки зі зразками ДНК, готовими до реакції. Вікіпедія

    Спочатку всі реагенти змішуються між собою. Грунтовки присутні в мільйони разів надлишок над шаблоном. Це важливо, тому що кожна новоспечена нитка ДНК починається з праймера. Перший етап процесу передбачає відділення ниток цільової ДНК шляхом нагрівання до майже кипіння.

    Далі розчин охолоджується до температури, яка сприяє пошуку взаємодоповнюючих послідовностей ДНК та створенню пар основ, процес, який називається відпалом. Оскільки праймери присутні у великому надлишку, додаткові послідовності, на які вони націлені, легко знаходять і підставляють до праймерів. Ці праймери направляють синтез ДНК. Тільки там, де праймер відпалює до ланцюга ДНК, відбудеться реплікація, оскільки ДНК-полімерази вимагають праймера, щоб почати синтез нової нитки.


    Малюнок 8.36 - Термоциклерна система ПЛР. Вікіпедія

    Розширення

    На третьому етапі процесу ДНК-полімераза відтворює ДНК шляхом розширення з 3' кінця праймера, створюючи нову нитку ДНК. В кінці першого циклу молекул ДНК вдвічі більше, як і при клітинній реплікації. Але в ПЛР процес повторюється, як правило, протягом від 25 до 30 циклів. Наприкінці процесу існує теоретичний вихід на 230 (понад 1 мільярд разів) більше ДНК, ніж було розпочато. (Ця величезна сила посилення є причиною того, що ПЛР настільки корисна для криміналістичних розслідувань, де на місці злочину може бути дуже крихітна кількість ДНК.)

    Температурні цикли контролюються в термоциклері, який багаторазово піднімає і знижує температуру відповідно до заданої програми. Так як кожен цикл може бути завершений за пару хвилин, все посилення може завершитися дуже швидко. Отримана ДНК аналізується на гелі, щоб переконатися, що вона має очікуваний розмір, і залежно від того, для чого вона повинна використовуватися, також може бути послідовною, щоб бути впевненим, що це бажаний фрагмент.

    мутагенез

    ПЛР часто використовується для отримання послідовностей генів, які слід клонувати у вектори для експресії білка, наприклад. Крім простоти і швидкості, ПЛР має і інші переваги. Оскільки можуть бути синтезовані праймери, які відрізняються від послідовності шаблонів в будь-якому заданому положенні, можна використовувати ПЛР для сайт-спрямованого мутагенезу. Тобто ПЛР може бути використана для мутації гена в потрібному положенні в послідовності. Це дозволяє експресувати, очищати та порівнювати білки, закодовані нормальними та мутантними генами.

    Аналіз експресії генів

    ПЛР також може використовуватися для вимірювання експресії генів. Там, де в ПЛР кількість ампліфікованого продукту не визначається до кінця всіх циклів, використовується варіація, яка називається кількісною ПЛР в реальному часі, в якій накопичення продукту вимірюється на кожному циклі. Це можливо, оскільки машини ПЛР в реальному часі мають модуль детектора, який може вимірювати рівні флуоресцентного маркера в реакції, з кількістю флуоресценції, пропорційною кількості посиленого продукту. Слідуючи за накопиченням продукту за циклами, можна розрахувати кількість стартового шаблону. Для вимірювання експресії генів використовується шаблон мРНК з зворотною транскрипцією в кДНК (див. Нижче). Ця зв'язок зворотної транскрипції з кількісною ПЛР в реальному часі називається Qrt-PCR.