8.6: Виділення генів

Раніше в цьому розділі ми обговорювали такі методи, як колоночна хроматографія, які використовуються для очищення цікавлять білків. Використовуючи комбінації цих методів, можна виділити білок до високого ступеня чистоти, що дозволяє вивчати активність і властивості білка. Цю проблему важче вирішити для нуклеїнових кислот. Геномна ДНК може бути легко отримана з клітин, але занадто складна для аналізу в цілому. Окремі гени - це одиниці ДНК, які відповідають білкам, і, таким чином, має сенс виділяти специфічні гени для дослідження. Методи виділення генів були недоступні до 1970-х років, коли відкриття рестрикційних ферментів і винахід молекулярного клонування вперше надали способи отримання великої кількості специфічних фрагментів ДНК для дослідження. Хоча для отримання великої кількості певного фрагмента ДНК молекулярне клонування значною мірою замінено прямою ампліфікацією за допомогою описаної пізніше полімеразної ланцюгової реакції, клоновані ДНК все ще дуже корисні з різних причин. Розвиток молекулярного клонування залежало від відкриття рестрикційних ендонуклеаз, описаних нижче.

Рестрикційні ферменти

Рестрикційні ферменти, або рестрикційні ендонуклеази, - це ферменти, вироблені бактеріями. Ці ферменти захищають бактерії, руйнуючи чужорідні молекули ДНК, які переносяться в їх клітини, наприклад, бактеріофагом, що вторгається. Кожен рестрикційний фермент розпізнає певну послідовність, зазвичай з чотирьох або шести нуклеотидів в ДНК. Ці послідовності, коли вони виникають у власній ДНК бактерії, хімічно модифікуються метилуванням, так що вони не розпізнаються та не деградуються. Там, де ці послідовності відбуваються в чужорідній ДНК, вони розрізаються рестрикцією ферменту.

Корисність та важливість рестрикційних ферментів полягає в їх здатності розпізнавати конкретні послідовності в ДНК та розрізати поблизу або (зазвичай) на місці, яке вони розпізнають. Відомо понад 3000 таких ферментів. Послідовності, розпізнавані цими ферментами, зазвичай мають довжину 4-8 пар основ, і найбільш часто використовувані ферменти розпізнають послідовності, описані як паліндромні.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): -Рестрикційний фермент, пов'язаний з послідовністю його розпізнавання на ДНК. Вікіпедія

Паліндром

У молекулярній біології термін паліндром означає, що послідовність місця розпізнавання при читанні в напрямку 5' до 3' для верхньої нитки точно така ж, як і у нижньої нитки. Розглянемо послідовність, визнану рестрикцією ферментом, відомим як Хінд III (вимовляється хін-ді-три). Це

5'
-А-А-Г-С-Т-Т-3' -Т-Т-Т-Ц-Г-А-5'

На верхній пасмі послідовність розпізнавання

5' АГАТТ 3'

яка така ж, як нижня пасмо (читати в тому ж напрямку 5' до 3').

Хоча всі рестрикційні ферменти повинні розпізнавати та зв'язуватися з певними послідовностями ДНК, точне місце, в якому вони розрізають ДНК, змінюється. Деякі ферменти залишають шахову послідовність після різання, яка має звис на 5' кінці однієї нитки дуплексу; деякі залишають шахову послідовність після різання, яка має звис на кінці 3'; а деякі стрижуть обидві пасма в одному місці, не залишаючи нависає послідовності - називається тупими кінцевими фрезами.

Розглянемо можливість вирізання послідовності ДНК, яка містить сайт розпізнавання Hind III, який

5'
-А-А-Г-С-Т-Т-3' -Т-Т-Т-Ц-Г-А-5'

Вбудована в послідовність ДНК, послідовність Hind III виглядала б так (Ns відповідають будь-якій базі і представляють всю ДНК навколо місця розпізнавання).

5'
-Н-Н-Н-А-А-Г-С-Т-Т-Н-Н-Н-3' -Н-Н-3 '-Н-Н-Т-Т-Ц-А-Н-Н-Н-5'

Після різання з Hind III це виглядало б наступним чином:

5' -Н-Н-Н-А 3' 5'А-Г-С-Т-Т-Н-Н-Н-Н-3'
-Н-Н-3' -Н-Н-Т-Т-Ц-Г-А-5' 3' А-Н-Н-Н-5'

де були вставлені зазори, щоб проілюструвати, де відбулося різання. Hind III розрізає між двома 'A', що містять нуклеотиди біля 5' кінця послідовності розпізнавання і, таким чином, залишає 5' звіси (рис.\(\PageIndex{2}\)).

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Результат різання ДНК з Hind III. Вікіпедія

З іншого боку, рестрикційний фермент Pst I розпізнає наступну послідовність

5'
-Н-Н-Н-С-Т-Г-С-С-А-Г-Н-Н-Н-Н-3' -Н-Н-3' -Н-Н-Г-А-С-Т-Н-Н-Н-5'

і розрізає між A і G поблизу 3' кінця послідовності розпізнавання.

5' -Н-Н-Н-С-Т-Г-С-А 3' 5'Г-Н-Н-Н 3' -Н-Н-Н
3' -Н-Н-Г 5' 3' А-С-Г-Т-С-Н-Н-Н 5'

Як бачите, різання ДНК за допомогою Pst I залишає 3' звіси послідовності розпізнавання. Кінці, що залишилися після різання ферментом рестрикції, які звисають або на кінці 5', або на кінці 3', називаються «липкими», оскільки вони можуть утворювати належні пари основи і більш легко бути з'єднані з аналогічним «липким кінцем». Це означає, що ви можете взяти два неспоріднених шматки ДНК, розрізати їх одним і тим же рестриктивним ферментом, щоб вони мали сумісні липкі кінці, а потім «склеїти» їх разом за допомогою ДНК-лігази, щоб сформувати нову гібридну молекулу, або рекомбінантну.

Виготовлення рекомбінантних ДНК

З'єднання фрагментів ДНК з різних джерел створює рекомбінантну ДНК. Здатність вирізати та вставляти ДНК може здатися чисто технічним подвигом, але одним із ключових застосувань, що виникло внаслідок цього, є молекулярне клонування. При молекулярному клонуванні цікавий ген може бути вставлений у вектор, як правило, плазміду, шляхом різання як вектора, так і гена (званого вставкою) з тим же ферментом, щоб генерувати липкі кінці і з'єднати дві частини разом, щоб генерувати рекомбінантний (Малюнок\(\PageIndex{3}\)). Плазміда - це тип автономно реплікуючої, екстрахромосомної ДНК. Досить просто витягти плазміди з клітин, спроектувати їх, щоб утримувати цікавий ген і повторно ввести рекомбінантну плазміду в бактерії. Ідея полягала в тому, що коли плазмідна ДНК була реплікована, додатковий вставлений ген також буде скопійований. Таким чином, виростивши багато бактерій, що несуть плазміду, можна отримати багато копій цікавить гена, щоб забезпечити достатню кількість гена для використання в експериментах. Хоча зараз у нас є простіші методи для досягнення цієї мети, клоновані ДНК залишаються дуже корисними. Наприклад, можна клонувати ген, який кодує цікавить білок, щоб він міг бути виражений на високих рівнях в клітині, в які вводиться рекомбінантна плазміда.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Побудова рекомбінантної ДНК. Вікіпедія

Незалежно від мети, для якої виготовляється рекомбінантна плазміда, вона, як правило, несе ген стійкості до антибіотиків (або гени), який називається селективним маркером. Клітини, які займають плазміду, зможуть рости в присутності антибіотика. Якщо бактеріальні клітини, до яких додана плазміда, будуть покриті на агар, що містить антибіотик, клітини, які взяли плазміду, зможуть рости, а інші - ні.

Малюнок\(\PageIndex{4}\): Карта сайту обмежень для плазмід PuC 18/19, класичний плазмідний вектор. Гени ідентифікуються стрілками. Цифри відповідають конвенції про нумерацію PuC 18/19

Клонування виразу

Як згадувалося вище, цікавий ген може бути вставлений у вектор, а рекомбінантна плазміда бути поміщена в клітину, де ген може бути експресований. Наприклад, можна клонувати ген кодування людського гормону росту або інсуліну або інших медично важливих білків і є бактерія або дріжджі зробити велику кількість його дуже дешево. Пам'ятайте, що це людські білки, і таким чином неможливо витягти білки в будь-якій кількості з людських суб'єктів.

Щоб клонувати ген, щоб він міг бути виражений, потрібно створити належні умови для того, щоб людський білок був зроблений у бактеріальних клітині. Зазвичай це передбачає використання спеціально розроблених плазмід. Ці плазміди були розроблені для 1) реплікації у великих кількостях; 2) несуть маркери, які дозволяють дослідникам ідентифікувати клітини, що несуть їх (наприклад, стійкість до антибіотиків) та 3) містять послідовності (такі як промотор та послідовність Shine Dalgarno), необхідні для експресії потрібного білка, з зручні ділянки для вставки цікавить гена у відповідне місце щодо контрольних послідовностей. Плазміда, яка має всі ці особливості, називається вектором виразу. На додаток до плазмід, які можуть бути використані для експресії в бактеріальних клітині, також доступні вектори експресії, які дозволяють експресію білка в різних еукаріотичних клітині.

Було створено безліч складних варіацій на таких векторах, які дозволили легко виробляти та очищати велику кількість будь-якого білка, для якого ген був клонований. Зручною особливістю деяких векторів експресії є послідовність, яка кодує тег спорідненості або вгору, або нижче за течією гена, що виражається. Ця послідовність дозволяє зливати короткий тег спорідненості (наприклад, пробіг залишків гістидину) на закодований білок. Тег може бути використаний для легкого очищення білка, як описано в розділі про афінної хроматографії.