8.10: Редагування геному (CRISPR)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 2628

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Розробка інструментів, які дозволили б вченим внести конкретні, цілеспрямовані зміни в геномі, був Святий Грааль молекулярної біології. Геніальний новий інструмент, який є простим та ефективним у внесенні точних змін, готовий революціонізувати поле, як це робила ПЛР у 1980-х роках. Відомий як система CRISPR/Cas9 і часто скорочується просто як CRISPR, він заснований на своєрідній бактеріальної імунної системи, яка дозволяє бактеріям розпізнавати та інактивувати вірусних загарбників.

CRSPR

CRISPR розшифровується як Clustered Регулярно перемежовуються короткі паліндромні повтори, короткі повторювані послідовності, знайдені в прокаріотичній ДНК, розділених розпірних послідовностей, отриманих від минулих зустрічей з, наприклад, бактеріофагом. Як і скляна тапочка, залишена Попелюшкою, яка згодом використовувалася для її ідентифікації, шматки послідовностей загарбника - це спосіб для бактерій ідентифікувати вірус, якщо він знову атакує. Вставлені в бактеріальний геном, ці послідовності згодом можуть бути транскрибовані в направляючу РНК, яка збігається, і базові пари з ділянками вірусного генома, якщо вона була повторена. Нуклеаза, пов'язана з напрямною РНК, потім розщеплює послідовність основи в парі з напрямною РНК. (Нуклеази називаються Cas для CRISPR-асоційованих.)

Основними елементами цієї системи є направляюча РНК, яка знаходиться в цільовій послідовності, і нуклеаза, яка може зробити розріз у послідовності, яка пов'язана напрямною РНК. За допомогою інженерного керівництва РНК, що доповнюють цільовий ген, можна націлити нуклеазу для розщеплення всередині цього гена. У системі CRISPR/Cas9 ендонуклеаза Cas9 вирізає обидві нитки послідовності генів, орієнтованої на направляючу РНК (рис.\(\PageIndex{1}\)). Це породжує двожильний розрив, який клітина намагається відновити.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): Направляюча РНК направляє нуклеазу Cas9 до свого гена-мішені. Зображення Пера Якобсена

Як ви пам'ятаєте, двониткові розриви ДНК можуть бути відновлені простим, негомологічним кінцевим з'єднанням (NHEJ) або гомологічною рекомбінацією. Коли перерва фіксується NHEJ, є велика ймовірність, що будуть видалення або вставки, які інактивують ген, в якому вони знаходяться. Таким чином, цілеспрямоване розщеплення сайту за допомогою CRISPR/Cas9 може легко і конкретно інактивувати ген, що полегшує характеристику функції гена.

Але, що робити, якщо ви хотіли просто мутувати ген на певному місці, щоб вивчити ефект мутації? Цього теж можна домогтися. Якщо передбачена гомологічна послідовність, що несе конкретну мутацію, гомологічна рекомбінація може відновити розрив, і в той же час вставити точну мутацію, бажану. Очевидно, що якщо ви можете вставити мутацію, як тільки що описано, можна виправити мутацію в геномі шляхом розщеплення у відповідній точці та надання правильної послідовності як шаблону для відновлення шляхом гомологічної рекомбінації. Простота системи має великі перспективи для лікування генетичних захворювань.

Вчені також придумали деякі креативні варіації на системі CRISPR/Cas9. Наприклад, один з варіантів інактивує нуклеазну активність Cas9. Направляюча РНК в цій системі пари з цільовою послідовністю, але Cas9 не розщеплює її. Натомість Cas9 блокує транскрипцію гена нижче за течією (рис.\(\PageIndex{2}\)) Цей метод дозволяє вимкнути конкретні гени без фактичного зміни послідовності ДНК.

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Неактивний Cas9 може блокувати транскрипцію гена-мішені. Зображення Пера Якобсена

Інша варіація також використовує відключений Cas9, але на цей раз Cas9 зливається з доменом активації транскрипції. У цій ситуації направляюча РНК позиціонує домен Cas9-активатора в місці, де він може посилити транскрипцію від конкретного промоутера (рис.\(\PageIndex{3}\)). Інші варіації на цю тему приєднують гістон-модифікуючі ферменти або метилази ДНК до неактивного Cas9. Знову ж таки, направляюча РНК розміщує Cas9 у потрібному місці, а фермент, приєднаний до Cas9, може метилювати ДНК або модифікувати гістони в цій області.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Злиття домену Cas9-активатора може активувати транскрипцію гена-мішені. Зображення Пера Якобсена

CRISPR вже використовується для редагування геномів у найрізноманітніших видах (і в культурах клітин людини). Це може пройти незадовго до того, як методика буде схвалена для клінічного застосування. Тим часом CRISPR трансформує молекулярну біологію.