8.11: Розщеплення білка

Last updated
Save as PDF

Page ID: 2604

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Через їх великих розмірів інтактні білки можуть бути важко вивчені за допомогою аналітичних методів, таких як мас-спектрометрія. Отже, часто бажано розбити великий поліпептид вниз на більш дрібні шматочки. Протеази - це ферменти, які зазвичай розривають пептидні зв'язки шляхом зв'язування з конкретними амінокислотними послідовностями в білку та каталізуючи їх гідроліз.

Хімічні реагенти, такі як бромід ціаногену, який розщеплює пептидні зв'язки на C-кінцевій стороні залишку метіоніну, також можуть бути використані для різання більших білків на більш дрібні пептиди. Загальні білки, що виконують цю діяльність, знаходяться в травній системі і показані нижче.

Субтілізин - C-кінцева сторона великих незаряджених бічних ланцюгів
Хімотрипсин - термінальна сторона C ароматичних речовин (Phe, Tyr, Trp)
Трипсин - С-кінцева сторона лізину і аргінінів (не поруч з проліном)
Карбоксипептидаза - N-кінцева сторона C-кінцевої амінокислоти
Еластаза - гідролізує C-сторону малих AaS (Gly, Ala)
Бромід ціаногену (хімічний) - Гідролізує C-сторону Met

Малюнок 8.45 - Місця розщеплення протеази на поліпептиді

Визначення маси і білкової послідовності

Мас-спектрометрія, як випливає з назви, - це метод, який може бути використаний для визначення мас молекул. Після обмежень аналізом малих молекул, він з тих пір був адаптований і вдосконалений, щоб дозволити аналіз біологічно важливих молекул, таких як білки та нуклеїнові кислоти. Мас-спектрометри використовують електричне поле для прискорення іонізованої молекули до детектора. Час, необхідний іонізованій молекулі для переміщення від точки іонізації до детектора, буде залежати як від її маси, так і від заряду і називається часом польоту (TOF).

МАЛЬДІ-TOF

Малюнок 8.46 - Настільна система MALDI-TOF

MALDI-TOF (Матрична лазерна десорбційна іонізація - час польоту) - аналітичний метод, що дозволяє визначити молекулярні маси біологічно відповідних молекул з великою точністю. Він зазвичай використовується в протеоміці і визначенні мас великих біомолекул, включаючи нуклеїнові кислоти. Розробка MALDI, яка дозволяє виробляти іонні форми відносно великих молекул, мала вирішальне значення для успішного використання мас-спектрометрії біомолекул. На малюнку 8.46 показана компактна система MALDI-TOF.

Процес MALDI-TOF включає три основні етапи. По-перше, матеріал, що підлягає аналізу, вбудований у твердий опорний матеріал (матрицю), який може випаровуватися у вакуумній камері за допомогою лазерного променя. У другій частині процесу лазер, орієнтований на матрицю, випаровує зразок, змушуючи молекули всередині нього випаровуватися і, в процесі, утворювати іони шляхом отримання або втрати протонів. По-третє, іони, створені таким чином у зразку, прискорюються електричним полем до детектора. Швидкість їх руху в бік детектора є функцією відношення їх маси до заряду (м/з). Іон з масою 100 і зарядом +1 буде рухатися в два рази швидше іона з масою 200 і зарядом +1 і з тією ж швидкістю, що і іон з масою 200 і зарядом +2. Таким чином, точно визначаючи час, необхідний для того, щоб іон перейшов від іонізації (нульовий час лазерної обробки) до виявлення, співвідношення маси до заряду для всіх молекул у зразку можна легко визначити.

Іонізація може призвести до дестабілізації більших молекул, які фрагментуються на менші в камері виявлення MALDI-TOF. Розмір кожного з субфрагментів більшої молекули дозволяє визначити її ідентичність, якщо це раніше не відомо. Цю фрагментацію можна навмисно посилити, зіткнувшись з прискореними іонами з інертним газом, таким як аргон.

Фрагментація молекули також може проводитися перед аналізом, як, наприклад, шляхом розщеплення білка на більш дрібні пептиди за допомогою ферментів або хімічних агентів. Амінокислотна послідовність білка може бути визначена за допомогою MALDI-TOF шляхом аналізу точних молекулярних мас багатьох коротких пептидних фрагментів, отриманих з білка. Коли одна амінокислота, наприклад, фрагменти від більшого пептиду, це можна виявити як різницю в масі між фрагментом з амінокислотою і без неї, так як кожна амінокислота буде мати характерну молекулярну масу. Шляхом відбитків пептидної маси і аналізу більш дрібних фрагментів окремих пептидів, таким чином, може бути визначена вся послідовність поліпептиду.