8.5: Транскриптоміка

Last updated
Save as PDF

Page ID: 2603

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Розглянемо матрицю, що містить всі відомі послідовності генів в геномі. Щоб зробити таку матрицю для аналізу, потрібно було б зробити копії кожного гена, або шляхом хімічного синтезу, або за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Потім нитки отриманих ДНК будуть розділені, щоб отримати одножильні послідовності, які можна було б прикріпити до чіпа. Кожна скринька сітки буде містити послідовність з одного гена. За допомогою цієї сітки можна було б проаналізувати транскриптом - всі мРНК, що виробляються у вибраних клітині в даний момент часу. Для простого аналізу можна було взяти тканину (скажімо печінку) і витягти з неї всі мРНК. Ця популяція мРНК представляє всі гени, які експресувалися в клітині печінки на момент вилучення РНК. Ці РНК повинні мати можливість гібридизувати (база-пара) з відповідними генами на мікромасиві. Гени, які не були виражені, не мали б мРНК, щоб зв'язуватися з відповідними генами на сітці.

Малюнок 8.25 - Копіювання і маркування транскриптома. Зображення Таралин Тан

На практиці МРНК не використовуються безпосередньо, а копіюються в одноланцюгові копії ДНК, які називаються CDNA. CDNA позначаються флуоресцентним барвником і додаються до мікромасиву в умовах, що дозволяють сполучення основи, щоб CDNA могли знайти і базову пару з комплементарними послідовностями на матриці (рис. 8.26). Потім матрицю промивають для видалення негібридизованих CDNA. Наявність/відсутність/велика кількість кожної мРНК потім легко визначається шляхом вимірювання кількості барвника в кожній коробці сітки.

Малюнок 8.26 - Додайте мічені CDNA до мікромасиву пластини. Зображення Таралин Тан

На малюнку 8.27 флуоресцентна кДНК прив'язана до місця в крайньому правому куті в третьому ряду сітки. Це означає, що послідовність кДНК доповнювала послідовність генної послідовності, іммобілізованої на цьому місці. Оскільки ідентичність генів у кожній позиції сітки відома, ми знаємо, що зразок містив мРНК, що відповідав цьому конкретному гену. Іншими словами, цей ген експресувався в клітині, з яких були отримані мРНК.

Малюнок 8.27 - Зв'язування флуоресцентної копії кДНК специфічної мРНК з ДНК, іммобілізованої на одному місці в мікромасиві. Вікіпедія

Більш потужний аналіз може бути проведений з двома наборами МРНК одночасно. Один набір CDNA може надходити з ракової тканини, а інший - з неракової тканини, наприклад. CDNA, отримані з кожного зразка, позначені різним кольором (скажімо, зеленим для нормального і червоним для ракових) (рис. 8.25). CDNA змішуються, а потім додаються до матриці і доповнюють послідовності знову дозволяють утворювати дуплекси (рис. 8.27).

Малюнок 8.28 - Аналіз мікромасиву, що порівнює експресію генів в нормальній і раковій клітині Вікіпедія

Негібридизовані CDNA змивають, а потім аналізують пластину. Червоні сітчасті коробки відповідають мРНК, присутній в раковій тканині, але не в неракової тканини. Зелені сітчасті коробки відповідають мРНК, присутній у нераковій тканині, але не в раковій тканині. Жовтий буде відповідати мРНК, присутнім в рівній кількості в двох тканині (рис. 8.28). Інтенсивність кожної плями також дає інформацію про відносні кількості кожної мРНК у кожній тканині.

Малюнок 8.29 - Автоматизований секвенсор високої пропускної здатності. Вікіпедія

Той же принцип, який використовується для мікромасивів нуклеїнових кислот, може бути адаптований для аналізу інших молекул. Наприклад, поліпептиди можуть бути пов'язані зі скляною гіркою замість ДНК, щоб створити білковий чіп. Білкові чіпси корисні для вивчення взаємодії білків з іншими молекулами, а також для діагностики.

Техніка РНК-SEQ

Як і мікромасиви, новий метод, який називається РНК-SEQ, є інструментом для одночасного виявлення та кількісного визначення всіх стенограм у заданому зразку. Цей метод спирається на нещодавно розроблені технології секвенування, які називаються секвенуванням наступного покоління або глибоким секвенуванням. Ці методи дозволяють швидко паралельно секвенувати мільйони фрагментів ДНК і, таким чином, можуть бути використані не тільки для геномної ДНК, але і для послідовності всіх зворотно-транскрибованих РНК з даного зразка.

Щоб визначити всі гени, що кодують білок, які експресувалися в певному наборі клітин за певних фізіологічних умов, вся мРНК спочатку буде витягнута та транскрибується в кДНК. Цей етап аналогічний підготовці зразків для мікромасивів. Однак на цьому етапі CDNA фрагментовані на менші шматки і мають невеликі адаптери послідовності, прикріплені на обох кінцях. Потім фрагменти піддаються високопродуктивному послідовності, щоб отримати короткі послідовності з усіх фрагментів. Ці дані вирівнюються з послідовністю генома і використовуються для вимірювання рівня експресії різних генів. РНК-SEQ пропонує деякі переваги перед мікромасивами. За допомогою мікромасивів РНК можна виявити лише в тому випадку, якщо відповідна їй послідовність генів присутня на сітці. У РНК-SEQ кожна РНК, присутня у зразку, послідовна, тому виявлення РНК не обмежується зондами на мікросхемі. РНК-SEQ є більш чутливим, ніж мікромасиви, і пропонує набагато більший діапазон, в якому експресію генів можна точно виміряти.