8.2: Методи фракціонування та хроматографії

Фракціонування зразків, як випливає з назви, - це процес виділення компонентів або фракцій лізату. Фракціонування зазвичай починається з центрифугування лізату. Використовуючи низькошвидкісне центрифугування, можна видалити залишки клітин, залишаючи супернатант, що містить вміст клітини. Використовуючи послідовно вищі швидкості центрифугування (і результуючі g сили) можна відокремити від цитоплазми різні клітинні компоненти, такі як ядра, мітохондрії тощо. Потім вони можуть бути окремо лізовані для вивільнення молекул, специфічних для конкретного клітинного відсіку. Розчинна фракція будь-якого лізату може бути додатково розділена на складові за допомогою різних методів.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): Високошвидкісна центрифуга може бути використана для отримання різних фракцій клітин з сирого лізату. Вікіпедія

Колонна хроматографія

Одним з потужних методів, використовуваних для цієї мети, є хроматографія. Ми розглянемо кілька хроматографічних підходів. Хроматографія використовується для виділення компонентів суміші на основі відмінностей в їх розмірах, заряді або інших характеристиках. Під час хроматографії рухлива фаза (буфер або інший розчинник) переміщається по стаціонарній фазі (зазвичай твердої матриці), що несе компоненти суміші. Поділ компонентів досягається, оскільки різні компоненти рухаються з різною швидкістю, з причин, які змінюються, залежно від типу використовуваної хроматографії. Ми розглянемо кілька різних видів хроматографії, щоб проілюструвати цей процес.

• Іонообмінна хроматографія
• Гелева виключення хроматографії
• Афінна хроматографія
• ВЕРХ

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Іонообмінна колонка апарату.Вікіпедія

Ці варіації на хроматографії виконуються при стаціонарній фазі, проведеної в межах так званих колонок (рис.\(\PageIndex{1}\)). Це трубки, що містять стаціонарну фазу (її ще називають «опорою» або твердою фазою).

Опори складаються з крихітних кульок, підвішених у буфері (рис.\(\PageIndex{3}\)) і призначені для використання хімії або різниці розмірів компонентів зразків і, таким чином, забезпечують засіб поділу. Колони «упаковуються» або заповнюються опорою, а буфер або розчинник несе суміш з'єднань, що підлягають розділенню через опору. Молекули в зразку диференційовано взаємодіють з опорою і, отже, переміщаються по ній з різною швидкістю, тим самим забезпечуючи розділення.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Іонообмінні намистини. Вікіпедія

Іонообмінна хроматографія

При іонообмінної хроматографії опора складається з крихітних кульок, до яких прикріплені хімічні речовини, що володіють зарядом. Перед використанням кульки врівноважують в розчині, що містить відповідний протиіон зарядженої молекулі на кульці. \(\PageIndex{5}\)На малюнку показана повторювана одиниця полістиролсульфонату - з'єднання, що використовується в якості катіонообмінної смоли. Як бачите, ця молекула негативно заряджена, і таким чином кульки будуть врівноваженими в буфері, що містить позитивно заряджений іон, скажімо натрій. У суспензії негативно заряджений полістиролсульфонат не в змозі покинути кульки, завдяки своїй ковалентної прикріплення, але контріони (натрій) можна «обміняти» на молекули того ж заряду.

Малюнок\(\PageIndex{4}\): Полістиролсульфонат, катіонообмінна смола. Вікіпедія

Біржі

Таким чином, катіонообмінна колона матиме позитивно заряджені контріони та негативно заряджені молекули, ковалентно прикріплені до кульок. Позитивно заряджені сполуки з клітинного лізату, що пройшли через колону, будуть обмінюватися з контріонами і «прилипати» до негативно заряджених сполук, ковалентно прикріплених до кульок. Молекули в зразку, які є нейтральними або негативно зарядженими, швидко пройдуть через колонку. У цей момент лише позитивно заряджені молекули з вихідного зразка будуть пов'язані з колоною. Потім вони можуть бути змиті або елюйовані, використовуючи буфери, що містять високі концентрації солі. За цих умов взаємодія між позитивно зарядженими молекулами та полістиросульфонатом буде порушена, що дозволило б відновити молекули, які були пов'язані з колоною.

Аніонний обмін

З іншого боку, в аніонообмінній хроматографії хімічні речовини, прикріплені до кульок, позитивно заряджені, а протиіони негативно заряджені (наприклад, хлорид). Негативно заряджені молекули в клітинному лізаті будуть «прилипати» і інші молекули пройдуть швидко. Щоб видалити молекули, «прилипли» до колони, потрібно просто додати високу концентрацію протиіонів, щоб звільнити їх.

Використовує

Іонообмінні смоли корисні для відділення заряджених від незаряджених або протилежно заряджених біомолекул в розчині. Смоли мають безліч інших застосувань, включаючи очищення та пом'якшення води. \(\PageIndex{5}\)На малюнку показано використання полістиролсульфонатного полімеру при видаленні кальцію для пом'якшення води.

Малюнок\(\PageIndex{5}\): Видалення іонів кальцію іонообмінником. Вікіпедія

Хроматографія виключення розміру

Хроматографія для виключення розміру (також називається хроматографія з молекулярним виключенням, хроматографія для виключення гелю або хроматографія з гель-фільтрацією) - це метод поділу з низькою роздільною здатністю, який використовує кульки з крихітними «тунелями» в них, кожен з яких має точний отвір. Розмір отвору називають «межею виключення», що означає, що молекули вище певної молекулярної маси не зможуть пройти через тунелі. Молекули з фізичними розмірами, більшими за межу виключення, не потрапляють в тунелі і проходять через колону відносно швидко, в просторах поза намистинами. Менші молекули, які можуть увійти в тунелі, роблять це, і, таким чином, мають довший шлях, який вони беруть, проходячи через колону і елютуть останніми (рис.\(\PageIndex{6}\)).

Малюнок\(\PageIndex{6}\): Поділ молекул за розміром у колонці для виключення розміру (він же гель-фільтрація)

\(\PageIndex{7}\)На малюнку показаний профіль групи білків, розділених методом виключення розміру хроматографії з використанням намистин з межею виключення близько 30 000 дальтон. Білки 30000 в молекулярній масі або більше елют в порожнечі об'ємі (зліва), тоді як більш дрібні білки елітуть пізніше (середній і правий).

Малюнок\(\PageIndex{7}\): Результат поділу виключення розміру. Вікіпедія

Афінна хроматографія

Аффінна хроматографія - це дуже потужна і селективна техніка, яка використовує спорідненість зв'язування молекул зразка (як правило, білків) для молекул, ковалентно пов'язаних з опорними кульками. На відміну від іонообмінної хроматографії, де всі молекули даного заряду зв'язуються з колоною, афінна хроматографія експлуатує специфічне зв'язування білка або білків з лігандом, який іммобілізується на кульках в колоні.

Наприклад, якщо хтось хотів відокремити всі білки в клітинному лізаті, які зв'язуються з АТФ, від білків, які не зв'язують АТФ, можна використовувати стовпець, який має АТФ, прикріплений до опорних кульок, і пропустити зразок через колонку. Всі білки, які зв'язують АТФ, будуть «прилипати» до стовпчика, тоді як ті, які не пов'язують АТФ, швидко пройдуть через нього. Потім зв'язані білки можуть бути звільнені з колонки, додаючи розчин АТФ, який витіснить зв'язані білки, конкуруючи за білки з АТФ, прикріпленим до матриці стовпців.

Гістидин позначення

Гістидин мічення (HIS-tagging) є особливим видом афінної хроматографії і є потужним інструментом для виділення рекомбінантного білка з клітинного лізату. Його мічення спирається на зміну області кодування ДНК для білка, щоб додати серію щонайменше шести залишків гістидину до аміно або карбоксильного терміналу закодованого білка. Цей «His-Tag» корисний для очищення тегованого білка, оскільки бічні ланцюги гістидину можуть зв'язуватися з іонами нікелю або кобальту. Поділ білків з міткою HIS від клітинного лізату відносно легко (рис.\(\PageIndex{8}\)). Проходження сирого клітинного лізату через колонку з нікелем або кобальтом, прикріпленим до кульок, дозволяє білкам з міткою HIS «прилипати», тоді як решта клітинних білків проходять швидко. Білки з міткою HIS потім елююються додаванням імідазолу до колони. Імідазол, який нагадує бічний ланцюг гістидину, конкурує з білками з міткою HIS і витісняє їх з колони. Хоча немічені білки в лізаті можуть також містити гістидин як частину своєї послідовності, вони не зв'язуватимуться зі стовпцем так сильно, як білок з тегом HIS, і, таким чином, будуть витіснені при менших концентраціях імідазолу, ніж це потрібно для елітування білка з тегом HIS. Дивно, але багато білки з тегами HIS, здається, нормально функціонують, незважаючи на додані гістидини, але при необхідності мітки гістидину можуть бути відщеплені від очищеного білка шляхом обробки протеазою, яка висікає додані гістидини, дозволяючи відновити потрібний білок з його нативною послідовністю.

Малюнок\(\PageIndex{8}\): Афінність хроматографічного очищення білка гістидином Tagging.Image by Aleia Kim

ВЕРХ

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) є потужним інструментом для поділу різноманітних молекул на основі їх диференціальних полярностей (рис.\(\PageIndex{9}\)). Більш ефективна форма колонної хроматографії, вона використовує колони з щільно упакованими опорами та дуже крихітними намистинами, такими що потік розчинників/буферів через колони вимагає високого тиску. Використовувані опори можуть бути полярними (нормальне поділ фаз) або неполярними (зворотне поділ фаз). При нормальному поділі фаз неполярні молекули елутуються спочатку, а потім більш полярні сполуки. Цей порядок перемикається при зворотній фазовій хроматографії. З двох зворотна фаза набагато частіше використовується через більш відтворюваних хроматографічних профілів (поділів), які вона зазвичай виробляє.

Малюнок\(\PageIndex{9}\): ВЕРХ: Насоси вліво/колонка в центрі/детектор праворуч. Вікіпедія