8.3: Електрофорез

Last updated
Save as PDF

Page ID: 2637

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Електрофорез використовує електричне поле, нанесене на гелеву матрицю, щоб відокремити великі молекули, такі як ДНК, РНК та білки, за зарядом та розміром. Зразки завантажуються в лунки гелевої матриці, яка може розділяти молекули за розмірами, і поперек гелю наноситься електричне поле. Це поле змушує негативно заряджені молекули рухатися до позитивного електрода. Гелева матриця сама по собі діє як сито, через яке швидко проходять найдрібніші молекули, в той час як більш довгі молекули повільніше рухаються.

Для ДНК і РНК сортування молекул за розміром таким способом є тривіальним, через рівномірного негативного заряду на фосфатній магістралі. Для білків, які змінюються за своїми зарядами, слід використовувати розумний трюк, щоб змусити їх імітувати нуклеїнові кислоти - див. Електрофорез поліакриламідного гелю (PAGE) нижче. Різні види гелів мають різний розмір пір. Як і сита з більш тонкими або грубими сітками, деякі гелі роблять кращу роботу з поділу менших молекул, тоді як інші працюють краще для більших. Гелевий електрофорез може застосовуватися як препаративна методика (тобто при очищенні білків або нуклеїнових кислот), але найчастіше його використовують як аналітичний засіб.

Агарозний гель електрофорез

Електрофорез з агарозним гелем - це методика, яка використовується для поділу нуклеїнових кислот переважно за розмірами. Агароза - полісахарид, отриманий з морських водоростей (рис. 8.11). Його можна розчинити в буфері для кипіння і вилити в лоток, де він встановлюється в міру охолодження (рис. 8.12), утворюючи плиту. Гелі агарози заливають гребінцем на місці, щоб зробити лунки, в які поміщаються зразки ДНК або РНК після затвердіння гелю. Гель занурюється в буфер і по всій плиті наноситься струм. Дволанцюгова ДНК має рівномірний негативний заряд, який не залежить від послідовного складу молекули. Тому, якщо фрагменти ДНК поміщаються в електричне поле, вони будуть мігрувати від катода (-) до анода (+). Швидкість міграції знаходиться в прямій залежності від здатності кожної молекули ДНК черв'як або погойдуватися своїм шляхом через просіюючий гель. Матриця агарози забезпечує отвори для переміщення макромолекул. Найбільші макромолекули мають найскладніший час навігації по гелю, тоді як найменші макромолекули прослизають крізь нього найшвидше.

Малюнок 8.11 - Будова полісахариду агарози. Вікіпедія

Оскільки електрофорез використовує електричний струм як силу для руху молекул через матрицю, молекули, що відокремлюються, повинні бути заряджені. Оскільки співвідношення розміру до заряду для ДНК і РНК є постійним для всіх розмірів цих нуклеїнових кислот, молекули просто сортують виходячи з їх розміру - найменші рухаються швидше, а найбільші рухаються повільніше.

Всі фрагменти заданого розміру будуть мігрувати на гелі однакову відстань, утворюючи на гелі так звані «смуги». Візуалізація фрагментів ДНК в гелі стає можливою завдяки додаванню барвника, такого як бромід етидію, який інтеркалюється між основами і флуоресцентами при огляді під ультрафіолетовим світлом (рис. 8.13) За допомогою запуску еталонних ДНК відомих розмірів поряд із зразками можна визначити розміри фрагментів ДНК у зразку. Корисно відзначити, що за умовністю фрагменти ДНК описуються не їх молекулярними масами (на відміну від білків), а довжиною в парах основ (bp) або кілобазах (kb).

Малюнок 8.12 - Агарозний гель електрофорез поділ ДНК - помаранчеві смуги є фрагментами ДНК. Вікіпедія

Малюнок 8.13 - ДНК-смуги, візуалізовані за допомогою фарбування бромідом етідію. Вікіпедія

Поліакриламідний гель електрофорез (PAGE)

Як і ДНК і РНК, білки є великими макромолекулами, але на відміну від нуклеїнових кислот, білки не обов'язково негативно заряджені. Заряд кожного білка залежить від його унікальної амінокислотної послідовності. Таким чином, білки в суміші не обов'язково будуть все рухатися в бік анода.

Крім того, тоді як дволанцюгова ДНК має стрижневу форму, більшість білків кулясті (складчасті). Далі білків значно менше нуклеїнових кислот, тому отвори матриксу гелю агарози просто занадто великі, щоб ефективно забезпечити поділ. Отже, незмінені (нативні) білки мають не дуже хороші перспективи для електрофорезу на агарозних гелів. Щоб відокремити білки по масі за допомогою електрофорезу, потрібно зробити кілька модифікацій.

Гелева матриця

Спочатку використовується матриця, виготовлена шляхом полімеризації та зшивання акриламідних одиниць. Мономерний акриламід (рис. 8.14) полімеризується і полімери зшиваються за допомогою N, N'-метилен-бісакриламіду (рис. 8.15) для створення сітчастої структури. Можна легко регулювати розмір отворів матриці/сітки, змінюючи відсоток акриламіду в реакції. Більш високі відсотки акриламіду дають менші отвори і більш ефективні для поділу менших молекул, тоді як більш низькі відсотки акриламіду використовуються при розсмоктуванні сумішей більших молекул. (Примітка: поліакриламідні гелі також використовуються для відділення невеликих фрагментів нуклеїнової кислоти, з деякими акриламідними гелями, здатними відокремлювати шматки ДНК, які відрізняються по довжині лише одним нуклеотидом.)

Малюнок 8.14 - акриламідний мономер. Вікіпедія

Малюнок 8.15 - N, N'-метиленебісакриламід - акриламідний зшиваючий реагент. Вікіпедія

Зміна заряду за допомогою SDS

Друге міркування полягає в тому, що білки повинні бути фізично змінені, щоб «представити» себе матриці, як негативно заряджені стрижні ДНК. Це досягається шляхом обробки білків аніонним миючим засобом SDS (додецилсульфат натрію). SDS денатурує білки, тому вони приймають стрижнеподібну форму, а молекули SDS покривають білки таким чином, що зовнішня поверхня завантажується негативними зарядами, маскуючи початкові заряди на білках і роблячи заряд на білках більш пропорційним їх масі, як кістяк ДНК.

Оскільки білки, як правило, мають дисульфідні зв'язки, які перешкоджають їх повністю розгортанню в миючому засобі, зразки кип'ятять з меркаптоетанолом, щоб розірвати дисульфідні зв'язки та забезпечити, щоб білки були максимально схожими на стрижень в SDS. Реагенти, такі як меркаптоетанол (а також дитиотреітол) - це сульфгідрилсодержащие реагенти, які окислюються в міру зменшення дисульфідних зв'язків в інших молекулах (див. Рис.

Малюнок 8.16 - Зменшення дисульфідних зв'язків дітіотреітолом. Вікіпедія

Гель для укладання

Третє міркування полягає в тому, що «гель для укладання» може бути використаний у верхній частині поліакриламідного гелю, щоб забезпечити спосіб стиснення зразків у щільну смугу перед тим, як вони потраплять в основний поліакриламідний гель (називається розсмоктуючим гелем). Подібно до того, як фрагменти ДНК в електрофорезі агарозного гелю сортуються на основі розміру (найбільший рух повільніше і найдрібніші рухаються швидше), білки мігрують через гелеву матрицю зі швидкостями, обернено пов'язаними з їх розміром. По завершенні електрофорезу білки можуть бути візуалізовані шляхом фарбування сполуками, які зв'язуються з білками, такими як Coomassie Brilliant Blue (рис. 8.17) або нітратом срібла.

Малюнок 8.17 - Два гелю SDS-PAGE - Білки - це сині смуги (забарвлені Coomassie Blue). Вікіпедія

Гелевий електрофорез без денатурування

Описана вище методика SDS_PAGE - найпоширеніший метод, який використовується для електрофоретичного поділу білків. У деяких ситуаціях, однак, білки можуть бути дозволені на так званих «нативних» гелів, при відсутності SDS. У цих умовах на рух білків через гель буде впливати не просто їх маса, а їх заряд при рН гелю, а також. Білки, що комплексуються з іншими молекулами, можуть рухатися як єдина сутність, дозволяючи виділяти зв'язуючих партнерів цікавлять білків.

Ізоелектричне фокусування

Білки значно різняться за своїми зарядами і, отже, за значеннями pI (рН, при яких їх заряд дорівнює нулю). Це можна використовувати для відділення білків в суміші. Розділення білків ізоелектричним фокусуванням вимагає встановлення градієнта рН в пробірці, що містить акриламідну гелеву матрицю. Розмір пор гелю регулюється, щоб бути великим, щоб зменшити ефект просіювання залежно від розміру. Молекули, що підлягають розділенню, наносяться на гель, що містить градієнт рН, і застосовується електричне поле. У цих умовах білки будуть рухатися відповідно до свого заряду.

Наприклад, позитивно заряджені молекули рухаються до негативного електрода, але оскільки вони рухаються через градієнт рН, проходячи через нього, вони досягають області, де їх заряд дорівнює нулю, і в цей момент вони перестають рухатися. Вони в цей момент притягуються ні до позитивного, ні негативного електрода і, таким чином, «фокусуються» на своєму pI (рис. 8.18). Використовуючи ізоелектричне фокусування, можна відокремити білки, значення pI яких відрізняються всього на 0,01 одиниці.

Малюнок 8.18 - Ізоелектричне фокусування: А. на початку пробігу; Б. в кінці пробігу

2D гелевий електрофорез

І SDS-PAGE, і ізоелектричне фокусування є потужними техніками, але розумне поєднання двох є потужним інструментом протеоміки - науки про вивчення всіх білків клітини/тканини одночасно. При 2-D гелевому електрофорезі спочатку готують лізат з цікавлять клітин. Білки в лізаті відокремлюються спочатку їх pI, через ізоелектричне фокусування, а потім за розміром SDS-PAGE.

Малюнок 8.19 - Схема виконання 2-D гелю аналізу. Зображення Алеї Кім

Суміш білків спочатку наносять на трубку або смужку (рис. 8.19, Крок 1), де проводиться ізоелектричне фокусування для поділу білків за їх значеннями pI (Крок 2). Далі, як показано на малюнку, гель, що містить білки, розділені їх ІП, повертають на бік і наносять уздовж верхньої частини поліакриламідної плити для SDS-PAGE, щоб відокремити за розміром (Крок 3). Білки в ізоелектричної фокусуючої матриці електрофорезуються в поліакриламідний гель і розділені на основі розміру. Продукт цього аналізу є 2-D гель, як показано на малюнку 8.20.Сила 2-D гелю електрофорезу полягає в тому, що практично кожен білок в клітині може бути відокремлений і з'являтися на гелі як пляма, що визначається його унікальним розміром і pI. На малюнку плями у верхньому лівому куті відповідають великим позитивно зарядженим білкам, тоді як ті, що знаходяться в нижньому правому куті, - невеликі негативно заряджені. Кожна пляма на 2-D гелі може бути елюйована та ідентифікована за допомогою мас-спектрометрії з високою пропускною здатністю. Це особливо потужно, коли порівнювати профілі білка між різними тканинами або між контрольними та обробленими зразками однієї і тієї ж тканини.

Малюнок 8.20 - Результат поділу електрофорезу 2-D гелю. Вікіпедія

Порівняння білкових профілів

Порівняння 2-D гелів білків з неракової тканини і білків з ракової тканини того ж типу забезпечує швидку ідентифікацію білків, рівень експресії яких відрізняється між ними. Така інформація може бути корисною при розробці методів лікування або в розумінні механізму (ів), за допомогою якого розвивається рак.