8: Аналіз ДНК
- Page ID
- 6493
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
- 8.1: Вступ
- Агароза - лінійний вуглеводний полімер, очищений від клітинних стінок деяких видів водоростей. Агар - це комбінація сирого екстракту, який містить агарозу та менший полісахарид агаропектину. При розчиненні і розплавленому в рідині пасма агарози сплутуються між собою, утворюючи сітку, яка утримує рідину в гелі. Зменшення рідини створює більший відсоток гелю, який є твердішим і містить менші пори всередині сітки.
- 8.2: Реплікація ДНК
- Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод швидкої ампліфікації або копіювання області ДНК в трубці. Як випливає з назви, методика використовує термостабільний фермент ДНК-полімерази для імітації в трубці того, що відбувається всередині клітини під час реплікації ДНК. Ланцюгова реакція дозволяє нам швидко копіювати ДНК з дуже дрібного вихідного матеріалу експоненціальним способом. Ця методика використовується в криміналістиці, генетичному тестуванні і клонуванні рідкісних генів.
- 8.3: Тандем змінного числа повторюється
- Різниця в нуклеотидних послідовностях між людьми лежить в межах 0,1-0,4%. Це означає, що люди більше ніж на 99% схожі. Але коли ви дивитесь на своїх однокласників по кімнаті, ви можете побачити, що ця невелика різниця становить зовсім небагато варіацій у нашому виді. Основна частина цих відмінностей навіть не в межах послідовностей кодування генів, а лежать зовні в регуляторних областях, які змінюють експресію цих генів.
- 8.5: Рестрикційні ферменти
- ДНК можна розрізати за допомогою рестрикційних ендонуклеаз (РЕ). Ендонуклеази - це ферменти, які можуть гідролізувати полімер нуклеїнової кислоти, розриваючи фосфодіефірний зв'язок між фосфатом і пентозою на кістці нуклеїнової кислоти. Молекулярні біологи також схильні використовувати ці спеціальні молекулярні ножиці, які розпізнають паліндроми 6 або 8. Використовуючи 6-різаки або 8-різаки, послідовності відбуваються на великих розтягуваннях рідко, але часто достатньо, щоб бути корисними.
- 8.6: ДНК-дактилоскопія (RFLP)
- Поліморфізм довжини рестрикційного фрагмента (RFLP) - це техніка, яка використовує варіації послідовностей ДНК. ДНК з різних джерел матиме варіації або поліморфізми протягом усієї послідовності. Використовуючи рестрикційні ферменти, ці відмінності в послідовності можуть бути дражнені. Однак, якби взяти весь геном людини і подрібнити його рестрикційним ферментом, було б зроблено багато нерашифрованих фрагментів.
- 8.7: Видобуток ДНК клітинок щоки
- Ця сторінка містить інструкції про те, як витягти клітини щоки за допомогою цитобруса, а також як використовувати кульки ПЛР.
- 8.8: D1S80 VNTR (генотипування)
- Міні-супутниковий маркер D1S80 розташований за адресою 1p35-p36. Цей ВНТР має довжину 16 основ. З варіацією алелів між 3-24 повторами, локус демонструє достатню різноманітність, щоб допомогти розрізняти людей. Хоча це не маркер CoDIS, для остаточної ідентифікації зразків необхідне використання декількох локусів. Великий повторення (16bp) дозволяє використовувати стандартний електрофорез агарозного гелю для вивчення різноманітності цього локусу в нашій лабораторії. Продукти ПЛР варіюються від 430 до 814 б.п.
- 8.9: Мініпреп ДНК шляхом лужного лізису (активність)
- Після того, як ДНК впроваджується та переноситься бактеріями, ми хотіли б знову ізолювати ДНК для подальших маніпуляцій. Для цього бактерії, що містять цікаву плазміду, вирощують у рідкій культурі багатому поживними речовинами бульйоні, виготовленому з дріжджового екстракту під назвою бульйон Лурія-Бертані (LB). Ці культивовані бактерії вирощуються до тих пір, поки вони не мають високої концентрації протягом ночі. Отримана гранула бактерій ресуспендується в фізіологічному буфері, що містить хелатор ЕДТА.
- 8.10: Секвенування ДНК Сангера
- Полімеризація нуклеїнових кислот відбувається в напрямку 5′ → 3′. Положення 5 ′ має фосфатну групу, тоді як 3′ положення гексози має гідроксильну групу. Полімеризація залежить від цих 2 функціональних груп для того, щоб відбулася реакція синтезу дегідратації та розширення цукрово-фосфатного хребта нуклеїнової кислоти. У 1970-х роках група Фреда Сангера відкрила принципово новий метод «читання» лінійної послідовності ДНК за допомогою спеціальних основ, званих ланцюговими термінаторами.
- 8.11: Послідовність наступного покоління
- Традиційне секвенування геномів було тривалим і виснажливим процесом, який клонував фрагменти геномної ДНК в плазміди для створення геномної бібліотеки ДНК (gDNA). Ці плазміди були індивідуально секвеновані за допомогою методології секвенування Сангера, і обчислювальні були виконані для ідентифікації частинок, що перекриваються, як головоломки. У міру вдосконалення технології вартість секвенування геномів стала менш дорогою. Ця технологія випередила закон Мура, що призвело до різкого зниження цін.