8.10: Секвенування ДНК Сангера

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6497

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Припинення радіоактивного ланцюга

Полімеризація нуклеїнових кислот відбувається в напрямку 5′ → 3′. Положення 5 ′ має фосфатну групу, тоді як 3′ положення гексози має гідроксильну групу. Полімеризація залежить від цих 2 функціональних груп для того, щоб відбулася реакція синтезу дегідратації та розширення цукрово-фосфатного хребта нуклеїнової кислоти. У 1970-х роках група Фреда Сангера виявила принципово новий метод «читання» лінійної послідовності ДНК за допомогою спеціальних основ, званих ланцюговими термінаторами або дидезоксинуклеотидами. Відсутність гідроксильної групи в положенні 3′ блокує полімеризацію, що призводить до припинення. Цей метод використовується і сьогодні і називається «метод припинення ланцюга дидезоксинуклеотидів Сангера». Цей метод спочатку використовував радіоактивно маркований праймер для ініціювання реакції секвенування. Відбуваються чотири реакції, де кожна реакція навмисно «отруюється» термінатором дидеокси-ланцюга. Наприклад, одну реакцію матимуть всі 4 dNTP (дезоксинуклеотидні трифосфати) з додаванням до невеликої кількості DDATP (дидезоксиаденозинтрифосфату). Ця реакція призведе до серії передчасних припинень полімеризації конкретно в різних місцях, де буде включений аденін.

DatP - природний мономер, який використовується при полімеризації ДНК. 3′-OH є точкою приєднання наступного наступного нуклеотиду.

Відсутність 3′-ОН у цій молекулі DDatP робить її ланцюговим термінатором, який заборонить додавання іншого нуклеотиду до полімеру ДНК.

Продукт цих 4 окремих реакцій секвенування виконується на великих поліакриламідних секвенуючих гелів. Найдрібніші фрагменти пробігають через гель найшвидше і створюють сходоподібний візерунок. Це можна візуалізувати за допомогою рентгенівської плівки, чутливої до радіоактивності. Кожна смуга гелю відповідає одній з чотирьох ланцюгових реакцій. Підстави зчитуються послідовно знизу вгору і виявляють послідовність ДНК.

Радіоактивне флуоресцентне

Гель для секвенування можна забити вручну. Профілі кожної смуги були створені за допомогою ImageJ для ілюстрації шаблону смуги та подальшої послідовності.

Кредит: Джон Шмідт та Джеремі Сето (CC-BY-SA 3.0)

Флуоресцентне припинення ланцюга та капілярний електрофорез

Кредит: Естевеж (CC-BY-SA 3.0)

Радіоактивність небезпечна і небажана для роботи, тому були розроблені ланцюгові термінатори з флуоресцентними мітками. Цей метод синтезує серію ниток ДНК, які є специфічно флуоресцентними при припиненні, що пропускається через систему капілярного електрофорезу. Коли фрагменти ДНК проходять лазер і детектор, різний флуоресцентний сигнал, що приписується кожному dDNTp, ідентифікується і генерує хроматограму для представлення послідовності. Флуоресцентні ланцюгові термінатори тепер використовуються в реакціях і проходять через невеликий капіляр. Найменші фрагменти проходять спочатку і виявляються для виявлення хроматограми.

Флуоресцентні хроматограми використовуються для оцінки припинення нуклеотидного ланцюга. Амплітуда кожного піку відповідає силі або визначеності виклику нуклеотидів. Файли хроматограми зазвичай надаються поряд з файлом послідовності з розширенням*.ab1, тоді як файли послідовності надаються у вигляді текстового файлу у форматі fasta. Детальніше про ці файли можна дізнатися тут. Файли ab1 надзвичайно важливі для аналізу, коли є помилки неоднозначності або послідовності. Ці файли ab1 також можуть бути використані для присвоєння оцінки якості на базовому виклику.

Коли в сигналі занадто багато неоднозначності через кілька піків, ви часто знайдете N замість одного з 4 нуклеотидів (A, T, C і G).

Це відео (джерело: www.yourgenome.org CC-BY) ілюструє механізм припинення флуоресцентного ланцюга та капілярного електрофорезу.

Секвенування геномів

Послідовність рушниці

Кредит: Джеремі Сето (CC-BY-NC-SA 3.0)

Традиційне секвенування геномів було тривалим і виснажливим процесом, який клонував фрагменти геномної ДНК в плазміди для створення геномної бібліотеки ДНК (gDNA). Ці плазміди були індивідуально секвеновані за допомогою методології секвенування Сангера, і обчислювальні були виконані для ідентифікації частинок, що перекриваються, як головоломки. Ця збірка призведе до проекту риштування.

Відео нижче взято з yourgenome.org (CC-BY) і ілюструє секвенування генома людини за допомогою підходу секвенування дробовика.