8.2: Реплікація ДНК

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 8.1: Вступ
- 8.3: Тандем змінного числа повторюється

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

реплікація постулату

Френсіс Крік запропонував 3 моделі того, як ДНК може відтворюватися. Кредит: Джеремі Сето (CC-BY 3.0)

Експеримент Месельсона та Шталя

Месельсон і Шталь

Meselson & Stahl виявили напівконсервативну реплікацію як метод шляхом використання радіомаркування ДНК у бактерій. Кредит: Джеремі Сето (CC0)

Реплікація машини

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод швидкої ампліфікації або копіювання області ДНК в трубці. Як випливає з назви, методика використовує термостабільний фермент ДНК-полімерази для імітації в трубці того, що відбувається всередині клітини під час реплікації ДНК. Ланцюгова реакція дозволяє нам швидко копіювати ДНК з дуже дрібного вихідного матеріалу експоненціальним способом. Ця методика використовується в криміналістиці, генетичному тестуванні і клонуванні рідкісних генів. Через експоненціальний процес копіювання бродяча клітина, що залишилася позаду, може забезпечити достатньо генетичного матеріалу, щоб зробити мільярди копій цієї ДНК. Процес ПЛР можна спостерігати в анімації, знайденій на веб-сайті навчального центру ДНК лабораторії Колд-Спрінг-Харбор
(http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html).

грунтовки та зворотне доповнення

Праймери зворотно доповнюють одну з 2 ниток ДНК. Вони фланкують область інтересів і стають включеними в реплікований продукт. Кредит: Джеремі Сето (CC-BY 3.0)

Як і в будь-якому процесі реплікації ДНК, потрібно починати з шаблону. Шаблон є вихідним матеріалом, який призначений для дублювання. У цьому процесі вчені не зацікавлені в копіюванні повноти генома цілком, лише невеликий сегмент інтересу. ДНК-полімерази вимагають праймерів для початку процесу полімеризації. Грунтовки розроблені у вигляді невеликих олігонуклеотидних сегментів, які обрамляють ділянку інтересу. Це короткі нитки ДНК, які зворотно доповнюють цікаву область ДНК, так що ДНК-полімераза має вихідну точку і орієнтується лише на сегмент ДНК, що цікавить. Ці грунтовки, як правило, мають довжину близько 18-24 основ.

Однак дволанцюгова молекула ДНК вже є основою в парі разом у подвійну спіраль, тому наші праймери не можуть взаємодіяти. Першим кроком ПЛР є відокремлення дволанцюгової молекули ДНК шляхом денатурації Н-зв'язків за допомогою високої температури (95° C). Концентрації праймера набагато вище вихідного шаблону. Наступний етап ПЛР називається відпалом. Під час цього етапу температура знижується до температури близько 55° C, ця температура все ще гаряча за нашими стандартами, але необхідна для підвищення жорсткості правильного сполучення ґрунтовки з їх цілями на шаблоні. ДНК-полімераза, що використовується в цьому процесі, походить від бактерії, яка живе при дуже високих температурах і не денатурує, як інші білки в таких умовах (термостабільні). Оригінальний фермент був виділений з організму під назвою Thermus aquaticus, тому ми називаємо фермент Taq полімеразою або просто Taq коротко. Ця бактерія живе в гарячих джерелах, де температура становить близько 50° C, але вона процвітає в діапазоні між 50-80° C. температура знову підвищується до більш високої температури 72° C для полімерази, щоб e продовжити (також називається подовженням) або продовжити етап полімеризації від праймера.

ПЛР досягається шляхом швидкої циклічності між цими трьома етапами: денатурою, відпалом та розширенням. Крок обмеження швидкості - це розширення, яке обмежує довжину ДНК, яку потрібно скопіювати. Якщо оригінальний шаблон є лише єдиним екземпляром, ми матимемо 2 копії після завершення циклу. Наступний цикл мав би 4 екземпляри, потім 8, потім 16, потім 32 і так далі. Процес подвоєння є експоненціальним, тому з 1 примірника проходить 30 циклів; ми мали б 2 ³⁰ або 1 073 741 824 примірники. Це понад мільярд копій за кілька годин часу.

експоненціальне посилення

Експоненціальна ампліфікація методом ПЛР. Кредит: Джеремі Сето (CC-BY 3.0)

Зовнішні ресурси

Покрокове керівництво кроків у ПЛР
- www.dnalc.org/Перегляд/15924-Створення багатокопій-дна.html