8.1: Вступ

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6509

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Агарозний гель електрофорез

Агароза - лінійний вуглеводний полімер, очищений від клітинних стінок деяких видів водоростей. Агар - це комбінація сирого екстракту, який містить агарозу та менший полісахарид агаропектину. При розчиненні і розплавленому в рідині пасма агарози сплутуються між собою, утворюючи сітку, яка утримує рідину в гелі. Зменшення рідини створює більший відсоток гелю, який є твердішим і містить менші пори всередині сітки.

Розміщення гребінця всередині розплавленої агарози створює простору, які дозволяють вставляти зразки, коли гель затвердіє. Молекули можуть проходити через пори, коли вони витягуються електричними струмами. Заряджені сполуки будуть мігрувати до електрода протилежного заряду, але на швидкість міграції впливатиме розмір молекул. Менші сполуки можуть легко пройти через лямку, тоді як більші елементи затримуються розміром пор. Дотримуйтесь цього моделювання, щоб отримати краще уявлення про те, як ми використовуємо електрофорез Agarose Gel в молекулярній біології для вивчення фрагментів ДНК.

Молекули ДНК не легко видно при розчиненні (відокремленні) на агарозному гелі. Для візуалізації молекул в гель необхідно ввести ДНК-барвник. У дослідницьких лабораторіях до розплавленого гелю додається агент інтеркаляції ДНК під назвою бромід етидію і зв'язується з ДНК зразків при запуску. Потім бромід етидію можна візуалізувати на УФ-коробці, яка флуоресцентує сполуку та виявляє смуги, де накопичується ДНК. Оскільки бромід етидію відомий як канцероген, навчальні лабораторії використовуватимуть більш безпечний агент для інтеркаляції ДНК, відомий як Sybr Green. Це можна візуалізувати подібним чином, але замість цього буде флуоресцентним зеленим кольором.

Гелі агарози

Гелі агарози візуалізуються на ультрафіолетовому трансілюмінаторі. Зліва показаний гель з бромідом етидію. Справа показаний гель з Sybr Green.

Агарозні гелі виготовляються і купаються в буферному розчині, як правило, трис-борат-ЕДТА (TBE) або трис-ацетат-ЕДТА (TAE). Незалежно від буферного розчину, буфер забезпечує необхідні електроліти для проходження струму і підтримки рН розчину.

Зразки ДНК готуються в буфері, подібному до розчину, в який він буде запущений, щоб гарантувати, що фосфатна основа ДНК залишається депротонованою і рухається до позитивного електрода. Додатково в цей буфер додають гліцерин або інше з'єднання для того, щоб розчин занурювався в лунки, не розтікаючись назовні. Барвник часто включається в цей завантажувальний буфер для того, щоб візуалізувати навантаження в колодязі і відстежувати відносне прогресування гелю.

Агарозний гель Set-Up

Натисніть тут, щоб переглянути відео «Збірка бурової установки та завантаження/Запуск гелю»:

Зовнішні ресурси

Електрофорез барвників (активність)

Приготуйте 1% гель агарози, додавши 60 мл буфера Tris-Borate-EDTA (TBE) до 0,6 г агарози в колбі Ерленмейера
Помістіть колбу в мікрохвильовку або на вогонь, поки агароза не розплавиться.
- Періодично зупиняйте і викручуйте розчин і не дайте закипіти.
Зберіть ливарний лоток, перекривши кінці стрічкою або пластиковими прокладками.
Помістіть гребінець в центр лотка для лиття.
Ви можете розмістити ливарні лотки всередині холодильника і залити розчин в лоток.
Дочекайтеся, поки гель застигне.
Акуратно відокремте прокладки від лотка.
Зніміть гребінку і помістіть лоток для лиття в камеру електрофорезу.
Накрийте гель буфером TBE.
Використовуючи мікропіпеттор, послідовно завантажуйте зразки барвника 40-50 мкл в свердловини.
Накрийте камеру електрофорезу кришкою і забезпечте хороший контакт між електродами.
- Звичайно, що ПОЗИТИВНА сторона резервуара найближча до вас.
- З додатною стороною, найближчою до вас, завантажте зразки зліва направо.
Встановіть блок живлення на 100-120В і натисніть кнопку Виконати (ви повинні бачити бульбашки на кожному електроді) і дайте попрацювати не менше 40 хвилин.
Через 40 хвилин зупиніть струм і видаліть гель в ливарний лоток.
Помістіть лоток на білому тлі і задокументуйте свій гель.

Подальша діяльність

1. Яких кольорів були барвники спочатку перед завантаженням в колодязі?

2. Скільки окремих смуг барвника знаходиться в кожній лунці після пробігу?

3. Що означає, що на смузі є кілька смуг? Що означає, що в смузі всього одна смуга?

4. Що нам ілюструє тривалість міграції щодо властивостей молекул барвника?

5. В якому напрямку мігрували молекули барвника? Що вказує напрямок міграції про аналітах?

6. Чи є смуги, де є кілька смуг одного кольору?