Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

8.6: ДНК-дактилоскопія (RFLP)

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6515

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Поліморфізм довжини рестрикційного фрагмента (RFLP) - це техніка, яка використовує варіації послідовностей ДНК. ДНК з різних джерел матиме варіації або поліморфізми протягом усієї послідовності. Використовуючи рестрикційні ферменти, ці відмінності в послідовності можуть бути дражнені. Однак, якби взяти весь геном людини і подрібнити його рестрикційним ферментом, було б зроблено багато нерашифрованих фрагментів. Насправді, отриманий гель агарози просто показував би великий мазок ДНК. Аналіз RFLP вимагає, щоб зонд до певної області ДНК був використаний для виявлення конкретних місць. Агарозні гелі будуть перенесені на мембрану або фільтр, де вони будуть гібридизовані до цих радіоактивних зондів.

    РФЛП

    Гомологічні хромосоми з рестрикційними ділянками, відміченими трикутниками. прямокутник, що сидить на хромосомах, відповідає локусу зонда. Кредит: Джеремі Сето (CC0)

    Аналіз RFLP був розроблений для криміналістики, щоб розрізняти людей. Так як люди 2N, у них є пари гомологічних хромосом з однаковими локусами. Однак ці локуси можуть містити різні алелі. У цьому випадку фенотип для цих алелів - це фактична послідовність, яка може містити або не містити місця обмеження. Наявність або відсутність місця обмеження може виникнути внаслідок одиночних нуклеотидних поліморфізмів (SNP), які виявляють природні варіації між людьми.
    Схема нижче ілюструє порівняння профілів обмежень між двома джерелами. Зверніть увагу, що зонд перекриває ділянку обмеження в одному з алелей. Цей зонд зможе зв'язати обидва фрагменти з урахуванням достатньої послідовності перекриття. Після розсмоктування на агарозному гелі геномна ДНК, яка не гібридизується з зондом, затьмарює цікавить вогнище як великий мазок. Фільтр розміщується поверх агарози і притискається до нього, щоб перенести ДНК в процесі, який називається Південним Блоттінгом. Після тривалого перенесення фільтр денатурують і інкубують з радіоактивним зондом. Для візуалізації цієї гібридизації зонда фільтру піддають плівку і обробляють.

    Південний Blot Робочий процес

    Після обмеження травлення зразки розчиняються на агарозному гелі. Перетравлення геномної ДНК призведе до великого мазка. Після перенесення ДНК на мембрану через капілярну дію мембрану зондують радіоактивною зондовою ДНК. Зонд вибірково зв'язується з додатковими послідовностями, щоб виявити ряд різних смуг. Інтерактивна демонстрація першої ДНК-дактилоскопії.

    Кредит: Одер Зейхнер: Ебігейл [або CC-BY-SA-3.0] /Авторадіограма

    RFLP картографування

    Зразок А показує лише одну смугу після обробки, оскільки ця людина гомологічна для того ж алеля. Зразок В гетерозиготний і розкриває три смуги.

    Кредит: Ретама (CC-BY-SA 4.0)

    RFLP представляють успадковані маркери і можуть виявляти відносини між різними особами. Родовід може проілюструвати взаємозв'язок успадкованих алелей. Методика може бути більш інформативною, якщо використовувати кілька зондів одночасно для різних локусів або використовувати багатолокусні зонди, які гібридизуються в декількох місцях.

    RFLP2

    RFLP можуть виникати через відмінності повторень STR/VNTR між сайтами обмежень. Кредит: Джеремі Сето (CC0)

    Хоча RFLP можуть виникати внаслідок SNP, вони також можуть бути викликані розширенням або скороченням повторюваних елементів між місцями обмеження. Ці повторювані елементи ДНК називаються тандемними повторами змінного числа (VNTR) і ілюструють поліморфізми, які зазвичай відбуваються в некодуючих областях генома.

    Пов'язані сторінки

    ДНК-дактилоскопія (активність)

    1. Походження зразків ДНК для цієї вправи буде пояснено інструктором, оскільки можуть бути використані численні сценарії (Edvotek Cat. #109).
    2. Приготуйте 1% гель агарози, додавши 60 мл буфера Tris-Borate-EDTA (TBE) до 0,6 г агарози в колбі Ерленмейера.
    3. Помістіть колбу в мікрохвильовку або на вогонь, поки агароза не розплавиться.
      • Періодично зупиняйтеся і закручуйте розчин. Не допускати закипання.
    4. Зберіть лоток для лиття, заблокувавши кінці скотчем або пластиковими кошиками.
    5. Помістіть гребінець у лоток для лиття на негативному кінці.
    6. У цей час інструктор додасть 6 мкл Sybr Safe до власного гелевого розчину.
    7. Ви можете розмістити ливарні лотки всередині холодильника і залити розчин в лоток.
    8. Дочекайтеся, поки гель застигне.
    9. Акуратно відокремте прокладки від лотка, щоб не відірвати лунки, зроблені гребінкою.
    10. Зніміть гребінку і помістіть лоток для лиття в камеру електрофорезу.
    11. Накрийте гель буфером TBE.
    12. Використовуючи мікропіпеттор, послідовно завантажуйте зразки барвника 40-50 мкл в свердловини.
    13. Накрийте камеру електрофорезу кришкою і забезпечте хороший контакт між електродами.
      • Звичайним є те, що ПОЗИТИВНА сторона резервуара найближча до вас.
      • З додатною стороною, найближчою до вас, завантажте зразки зліва направо.
    14. Встановіть блок живлення на 100-120В, натисніть кнопку Виконати (ви повинні бачити бульбашки на кожному електроді), і дайте попрацювати не менше 40 хвилин.
    15. Через 40 хвилин зупиніть струм і видаліть гель в ливарний лоток.
    16. Просуньте гелі в фарбувальний розчин, якщо вони не включають Sybr Safe для візуалізації наступного часу зустрічі.
    17. Інструктор проведе гель на ультрафіолетовий трансілюмінатор за щитом і покаже результати заняттю.
      • Документуйте висновки гелю, фотографуючи за допомогою телефону.
      • Інструктор обговорить результати і попросить вас інтерпретувати висновки.

    Подальша діяльність

    1. Чому зразки завантажуються при негативній стороні гелю?

    2. Яка роль барвника в цих зразках? Чи варто насторожитися, що зразки все одного кольору?

    3. Що означає, що на смузі є кілька смуг? Що означає, що в смузі є тільки одна смуга?

    4. Що можна зробити з бандажних шаблонів у цій судовій експертизі чи справі про батьківство? Чи достатньо цих даних для цих висновків?