11.5: Трансгенні тварини
- Page ID
- 5862
Трансгенна тварина - це та, яка несе чужорідний ген, який навмисно вставлений у його геном. Чужорідний ген будується за методологією рекомбінантної ДНК. На додаток до самого гена, ДНК зазвичай включає інші послідовності, щоб дозволити йому бути включеною в ДНК господаря і правильно експресуватися клітинами господаря. Виробляються трансгенні овець та кіз, які експресують чужорідні білки у своєму молоці. Трансгенні кури тепер здатні синтезувати людські білки в «білих» своїх яйцях. Ці тварини повинні в кінцевому підсумку виявитися цінними джерелами білків для людської терапії.
У липні 2000 року дослідники з команди, яка виробляла Доллі, повідомили про успіх у виробництві трансгенних ягнят, в яких трансген був вставлений на певному місці в геномі і функціонував добре.
Трансгенні миші надали інструменти для вивчення багатьох біологічних питань.
Звичайні миші не можуть бути заражені вірусом поліомієліту. Їм не вистачає молекули поверхні клітини, яка у людини служить рецептором вірусу. Тож звичайні миші не можуть служити недорогою, легко маніпульованою моделлю для вивчення захворювання. Однак трансгенні миші, що експресують ген людини для рецептора вірусу поліомієліту
- може бути заражений вірусом поліомієліту і навіть
- розвиваються паралічі та інші патологічні зміни, характерні для захворювання у людини.
Широко використовуються два методи виробництва трансгенних мишей:
- перетворення ембріональних стовбурових клітин (ЕС-клітин), що ростуть в культурі тканин з потрібною ДНК
- введення потрібного гена в пронуклеус заплідненої яйцеклітини миші
Рис.11.4.1 Методи отримання трансгенних мишей
Метод ембріональних стовбурових клітин - метод 1
Ембріональні стовбурові клітини (ЕС-клітини) збирають з внутрішньої клітинної маси (ІКМ) мишачих бластоцист. Їх можна вирощувати в культурі і зберігати весь свій потенціал для виробництва всіх клітин зрілої тварини, включаючи її гамети.
1. Зробіть свою ДНК
Використовуючи рекомбінантні методи ДНК, побудувати молекули ДНК, що містять- ген, який ви хочете (наприклад, ген інсуліну)
- векторна ДНК, щоб дозволити молекули бути вставлені в молекули ДНК господаря
- послідовності промоторів та підсилювачів, що дозволяють експресувати ген клітинами-господарями
2. Трансформація ES клітин в культурі
Піддайте культивовані клітини ДНК, щоб деякі включили її.3. Виберіть для успішно перетворених комірок
4. Вводять ці клітини у внутрішню клітинну масу (ICM) мишачих бластоцист.
5. перенесення ембріонів
- Підготуйте псевдовагітну мишу (шляхом спарювання самки миші з вазектомізованим самцем). Стимул спарювання викликає гормональні зміни, необхідні для того, щоб зробити її матку сприйнятливою.
- Перенесіть ембріони в її матку.
- Сподіваємося, що вони успішно імплантують і розвиваються в здорових цуценят (не більше третини волі).
6. Перевірте її потомство
- Видаліть невеликий шматочок тканини з хвоста і вивчіть його ДНК на предмет потрібного гена. Його матимуть не більше 10— 20%, і вони будуть гетерозиготними для гена.
7. Встановити трансгенний штам
- З'єднайте двох гетерозиготних мишей і перевіряйте їх потомство на предмет 1 в 4, який буде гомозиготним для трансгена.
- Спаровування цих виявить трансгенний штам.
Метод Пронуклеуса - Спосіб 2
1. Підготуйте свою ДНК, як у способі 1
2. Перетворіть запліднені яйц
- Збирайте свіжозапліднені яйцеклітини до того, як головка сперми перетворилася на пронуклеус.
- Введіть чоловічий пронуклеус з вашої ДНК.
- Коли пронуклеї злилися, утворюючи диплоїдне ядро зиготи, дозвольте зиготі ділитися мітозом, утворюючи 2-клітинний ембріон.
3. Імплантувати ембріони у псевдовагітної прийомної матері і діяти, як у способі 1.
На цьому зображенні (люб'язно надано Р.Л. Брінстер і Р.Е. Хаммер) зображена трансгенна миша (праворуч) з нормальним поміщиком (ліворуч). Гігантська миша розвинулася з заплідненої яйцеклітини, перетвореної рекомбінантною молекулою ДНК
- ген для людського гормону росту
- сильний промотор генів миші
Рівні гормону росту в сироватці деяких трансгенних мишей були в кілька сотень разів вище, ніж у контрольних мишей.
Випадкова проти цільової вставки генів
Ранні вектори, що використовуються для введення генів, могли розмістити ген (від однієї до 200 його копій) в будь-якому місці генома. Однак, якщо ви знаєте деякі послідовності ДНК, що фланкують певний ген, можна розробити вектори, які замінюють цей ген. Ген заміщення може бути таким, який- відновлює функцію у тварини-мутанта або
- вибиває функцію конкретного локуса.
- бажаний ген
- neo r, ген, який кодує фермент, який інактивує антибіотик неоміцин та його родичів, як препарат G418, який є смертельним для клітин ссавців
- tk, ген, який кодує тимідинкіназу, фермент, який фосфорилює нуклеозидний аналог ганцикловіру. ДНК-полімераза не може дискримінувати отриманий нуклеотид і вставляє цей нефункціональний нуклеотид у свіжореплікуючу ДНК. Так ганцикловір вбиває клітини, які містять ген tk
Крок 1
Лікувати культуру ЕС-клітин препаратом векторної ДНК.Результати:
- Більшість клітин не можуть взяти вектор; ці клітини будуть вбиті, якщо піддаються впливу G418.
- У декількох клітинок: вектор вставляється випадковим чином в геном. При випадковій вставці весь вектор, включаючи ген tk, вставляється в ДНК господаря. Ці клітини стійкі до G418, але вбивають ганцикловіром.
- У ще менше клітин: відбувається гомологічна рекомбінація. Розтяжки послідовності ДНК у векторі знаходять гомологічні послідовності в геномі господаря, а область між цими гомологічними послідовностями замінює еквівалентну область в ДНК господаря.
Крок 2
Культуру суміші клітин в середовищі, що містить як G418, так і ганцикловір.- Клітини (більшість), які не змогли зайняти вектор, вбивають G418.
- Клітини, в які вектор був вставлений випадковим чином, вбивають ганцикловіром (оскільки вони містять ген tk).
- Це залишає популяцію клітин, перетворених гомологічною рекомбінацією (збагаченою в кілька тисяч разів).
Крок 3
Введіть їх у внутрішню клітинну масу мишачих бластоцист.
нокаут мишей: чому вони нас вчать?
Якщо ген заміщення (A* на діаграмі) нефункціональний («нульовий» алель), спаровування гетерозиготних трансгенних мишей дасть штам "нокаут-мишей" гомозиготний для нефункціонального гена (обидві копії гена в цьому місці були «вибиті»). Миші-нокаут є цінними інструментами для виявлення функції (ів) генів, для яких мутантні штами раніше не були доступні. Виникло два узагальнення в результаті вивчення нокаут-мишей:
- Миші з нокаутом часто напрочуд не схильні до їх дефіциту. Багато гени виявляються не незамінними. Геном миші, здається, має достатню надмірність, щоб компенсувати одну відсутню пару алелей.
- Більшість генів плейотропні. Вони виражаються в різних тканині по-різному і в різний час розвитку.
Тканинні специфічні миші для нокауту
Хоча гени «домашнього господарства» експресуються у всіх типах клітин на всіх стадіях розвитку, інші гени зазвичай експресуються лише в певних типах клітин при включенні відповідними сигналами (наприклад, надходження гормону).
Для вивчення таких генів можна було б очікувати, що методи, описані вище, спрацюють. Однак виявляється, що гени, які виражаються лише в певних тканині дорослої людини, все ж можуть бути життєво важливими під час ембріонального розвитку. У таких випадках тварини не виживають достатньо довго, щоб їх ген нокауту вивчався. На щастя, зараз існують методи, за допомогою яких трансгенні миші можуть бути зроблені там, де певний ген вибивається лише в одному типі клітин.
Система Cre/ LoXP
Один з бактеріофагів, що заражає кишкову паличку, називається P1, виробляє фермент - призначений Cre - який розрізає його ДНК на довжини, придатні для упаковки в свіжі вірусні частинки. Cre розрізає вірусну ДНК всюди, де вона стикається з парою послідовностей, позначених LoXp. Вся ДНК між двома сайтами LoXp видаляється, а решта ДНК знову перев'язана разом (тому фермент є рекомбіназою). Використовуючи «Спосіб 1» вище, мишей можна зробити трансгенними для
- ген, що кодує Cre, приєднаний до промотора, який буде активований лише тоді, коли він пов'язаний тими ж транскрипційними факторами, які включають інші гени, необхідні для унікальної функції цього типу клітини;
- ген «цільової», той, функція якого повинна бути вивчена, фланкується послідовностями LoXp.
- ті клітини, які
- отримувати сигнали (наприклад, прихід гормону або цитокіну)
- включити виробництво необхідних факторів транскрипції
- активувати промотори генів, продукти яких потрібні саме цьому виду клітин
- Всім іншим клітинам бракує факторів транскрипції, необхідних для зв'язування з промотором Cre (та/або будь-якими підсилювачами), тому цільовий ген залишається недоторканим.
Результат: миша з певним геном вибивається тільки в певних клітині.
Стукати мишей
Система Cre/ LoXP також може бути використана для
- видалити послідовності ДНК, які блокують транскрипцію генів. Ген «цільової» потім може бути включений в певних клітині або в певний час, як того бажає експериментатор.
- замінити один із власних генів миші новим геном, який дослідник бажає вивчити.
Таких трансгенних мишей називають «стукаються» мишами.
Трансгенні вівці та кози
До недавнього часу трансгени, введені в овець, вставлялися випадковим чином в геном і часто працювали погано. Однак у липні 2000 року повідомлялося про успіх при вставці трансгена в конкретний генний локус. Ген був людським геном альфа1-антитрипсину, і двоє тварин експресували велику кількість людського білка у своєму молоці.
Ось як це було зроблено.
Фібробласти овець (клітини сполучної тканини), що ростуть в культурі тканин, обробляли вектором, який містив ці сегменти ДНК:
- 2 області, гомологічні гену овець COL1A1. Цей ген кодує колаген 1 типу. (Його відсутність у людини викликає спадкове захворювання недосконалість остеогенезу.)
Цей локус був обраний тому, що фібробласти виділяють велику кількість колагену, і, таким чином, можна було б очікувати, що ген буде легко доступний у хроматині.
- Ген стійкості до неоміцину, який допомагає ізолювати ті клітини, які успішно включили вектор.
- Ген людини, що кодує альфа1-антитрипсин.
Деякі люди успадковують два не- або погано функціонуючих гени для цього білка. Його низький рівень або відсутність викликає захворювання Дефіцит Альфа1-антитрипсину (A1AD або Alpha1). Основними симптомами є ураження легенів (а іноді і печінки).
- Сайти промоторів з гена бета-лактоглобуліну. Вони сприяють експресії генів на основі гормонів у клітині, що виробляють молоко.
- Сайти зв'язування рибосом для ефективного трансляції мРНК бета-лактоглобуліну.
- Зплавлений з енуклейованими яйцями овець і імплантований в матку вівці (самки овець)
- Кілька ембріонів збереглися до свого народження, а два молодих ягнятка жили більше року.
- При лікуванні гормонами ці два ягнята виділяли молоко, що містить велику кількість альфа1-антитрипсину (650 мкг/мл; в 50 разів вище попередніх результатів за допомогою випадкового введення трансгена).
18 червня 2003 року компанія, яка виконує цю роботу, відмовилася від неї через великі витрати на будівництво об'єкта для очищення білка від овечого молока. Очищення важливо, оскільки навіть коли 99,9% чисті, пацієнти людини можуть виробляти антитіла проти крихітних кількостей овечих білків, які залишаються.
Однак інша компанія, GTC Biotherapeutics, наполегливо і в червні 2006 року отримала попереднє схвалення на ринок людського білка, антитромбіну, в Європі. Їх білок - перший зроблений у трансгенної тварини, яка отримала регуляторне схвалення для терапії людиною - виділявся в молоці трансгенних кіз.Трансгенні кури
Кури ростуть швидше, ніж овець і кіз, і велику кількість можна вирощувати в тісних кварталах. Вони також синтезують кілька грамів білка в «білих» яйцях. Два методи досягли успіху у виробництві курей, що несуть та експресують чужорідні гени.
- Зараження ембріонів вірусним переносником
- людський ген для терапевтичного білка
- послідовності промоторів, які реагуватимуть на сигнали для внесення білків (наприклад, лізоциму) у яєчному білку
- Трансформація сперми півня з геном людини і відповідними промоторами і перевірка на наявність будь-якого трансгенного потомства.
Попередні результати обох методів вказують на те, що кури можуть виробляти до 0,1 г людського білка в кожному яйці, яке вони відкладають.
Це не тільки повинно коштувати менше, ніж виробництво терапевтичних білків у культуральних судибах, але кури, ймовірно, додадуть правильні цукри до глікозильованих білків - те, чого не може зробити кишкова паличка.
Трансгенні Свині
Трансгенні свині також виробляються шляхом запліднення нормальних яйцеклітин сперматозоїдами, які включили чужорідну ДНК. Ця процедура, яка називається перенесенням генів, опосередкованих спермою (SMGT), може коли-небудь отримати трансгенних свиней, які можуть служити джерелом трансплантованих органів для людини.
трансгенні примати
У 28 травня 2009 року випуску Nature японські вчені повідомили про успіх у створенні трансгенних мармозетів. Мармосети - це примати і, отже, наші найближчі родичі (поки що) повинні бути генетично інженерними. У деяких випадках трансген (для зеленого флуоресцентного білка) був включений в зародкову лінію і передавався потомству тварини. Сподіваємося, що ці трансгенні тварини забезпечать найкращу модель для вивчення захворювань людини та можливих методів лікування.