11.10: Антисенсова РНК

Месенджерна РНК (мРНК) одножильна. Його послідовність нуклеотидів називається «сенсом», оскільки вона призводить до генного продукту (білка). У нормі його непарні нуклеотиди «зчитуються» трансферними РНК антикодонами, коли рибосома переходить до перекладу повідомлення.

Малюнок 11.9.1 Почуття пасма

Однак РНК може утворювати дуплекси так само, як це робить ДНК. Все, що потрібно - це друга пасмо РНК, послідовність основ якої доповнює першу пасмо.

Приклад

5' C A U G 3' мРНК
3' G U A C 5' Антисенс-РНК

Друга нитка називається антисенсовою ниткою, оскільки її послідовність нуклеотидів є доповненням сенсу повідомлення.

Малюнок 11.9.2 Антисенсова РНК

Коли мРНК утворює дуплекс з комплементарною антисенсовою послідовністю РНК, трансляція блокується. Це може статися через те, що рибосома не може отримати доступ до нуклеотидів в мРНК або тому, що дуплексна РНК швидко деградується рибонуклеазами в клітині. За допомогою рекомбінантних методів ДНК в організм можуть вводитися синтетичні гени (ДНК), що кодують молекули антисенсивної РНК.

Приклади

Смак Savr томатний

Більшість помідорів, які доводиться відправляти на ринок, збирають до того, як вони дозріють. В іншому випадку етилен, синтезований помідором, змушує їх дозрівати і псуватися, перш ніж вони потраплять до клієнта. Були побудовані трансгенні помідори, які несуть у своєму геному штучний ген (ДНК), який транскрибується в антисенсову РНК, що доповнює мРНК для ферменту, що бере участь у виробництві етилену. Ці помідори складають всього 10% від нормальної кількості ферменту.

Мета цієї роботи полягала в тому, щоб забезпечити помідори супермаркету чимось ближче до зовнішнього вигляду і смаку томатів, зібраних при дозріванні. Однак ці помідори часто пошкоджувалися під час відвантаження та обробки і були зняті з ринку.

Трансгенний тютюн

Рис.11.9.3 квітка тютюну

Квітка тютюнової рослини, що несе трансген, розшифровка якого є антисенсом до однієї з мРНК, необхідних для нормальної квіткової пігментації.

Трансгенна квітка

Малюнок 11.9.4 Трансгенна квітка

Квітка іншої трансгенної рослини, яка не змогла змінити нормальну пігментацію.

Виготовлення трансгенних рослин

Існує кілька методів введення генів в рослини, в тому числі

• зараження рослинних клітин плазмідними векторами, що несуть потрібний ген
• зйомка мікроскопічних гранул, що містять ген безпосередньо в клітину

На відміну від тварин, немає реальної різниці між соматичними клітинами і статевими клітинами. Соматичні тканини рослин, наприклад, кореневі клітини, вирощені в культурі,

• може трансформуватися в лабораторії з потрібним геном
• вирощені в зрілі рослини з квітами.

Якщо все піде добре, трансген буде включений в пилок і яйцеклітини і передається наступному поколінню.

У цьому відношенні легше виробляти трансгенні рослини, ніж трансгенні тварини.

Антисенс-РНК також виникає природним шляхом.

Чи містять клітини гени, які природним чином переводяться в молекули антисенсивної РНК, здатні блокувати трансляцію інших генів у клітині? Відповідь - так, і вони, здається, являють собою інший метод регулювання експресії генів. Як у мишей, так і у людини ген інсуліноподібного фактора росту 2 рецептора (IgF2r), який успадковується від батька, синтезує антисенсову РНК, яка, здається, блокує синтез мРНК для IgF2r. Успадкована різниця в експресії гена в залежності від того, успадковується він від матері або батька, називається геномним або батьківським імпринтингом.

РНК-інтерференції (РНК)

При тестуванні ефектів антисенсової РНК слід використовувати чуттєву РНК тієї ж області кодування в якості контролю. Дивно, але препарати чуттєвої РНК часто виявляються настільки ж ефективним інгібітором, як антисенсова РНК.

Чому? Здається, що препарати чуттєвої РНК часто забруднені гібридами: чуттєвими і антисенсовими нитками, які утворюють подвійну спіраль дволанцюгової РНК (ДСРНК). Дволанцюгова РНК, що відповідає певному гену, є потужним придушувачем цього гена. Насправді, супресивний ефект антисенсової РНК, ймовірно, також залежить від її здатності утворювати dsRNA (використовуючи відповідну мРНК як шаблон).

Здатність dsRNA пригнічувати експресію гена, відповідного власній послідовності, називається інтерференцією РНК (РНК). Його також називають посттранскрипційним глушінням генів або ПТГС.

Механізм РНІ

Єдині молекули РНК, які зазвичай знаходяться в цитоплазмі клітини, - це молекули одноцепочечной РНК. Якщо клітина знаходить молекули дволанцюгової РНК (dsRNA), вона використовує фермент під назвою Dicer, щоб розрізати їх на фрагменти, що містять ~ 21 пару основ (~ 2 витка подвійної спіралі). Потім дві нитки кожного фрагмента відокремлюються - звільняючи антисенсову пасмо. За допомогою білка він зв'язується з додатковою послідовністю почуттів на молекулі мРНК. Якщо сполучення основи є точним, мРНК руйнується. Через свою дію ці фрагменти РНК отримали назву «мала (або коротка) інтерференційна РНК» (SiRNA). Комплекс SiRNA і білка називається "R NA- він індукується як комплекс ілінсингу c» (RISC).

SirNAS також можуть перешкоджати транскрипції

Зростає кількість доказів того, що sirNAS також можуть пригнічувати транскрипцію генів.

• можливо, шляхом зв'язування з комплементарними послідовностями на ДНК або
• можливо, шляхом прив'язки до зароджується стенограми РНК у міру її формування.

У дріжджах ділення, по крайней мере, SirNA комплексується однією молекулою кожного з трьох різних білків. Весь комплекс називається комплексом RITS («R NA- це індукована ініціація його транскрипційного гена як мовлення»).

Як ці SirNA — синтезовані в цитозолі — отримують доступ до ДНК в ядрі, невідомо.

Синтетичні молекули SiRNA, які зв'язуються з промоторами генів, можуть - в лабораторії - пригнічувати транскрипцію цього гена. Репресія опосередкована метилуванням ДНК в промоторі і, можливо, метилюванням гістонів поблизу.

Існує штам рису (LGC-1), який виробляє аномально низький рівень білків, званих глютелінами. Виявляється, що з декількох генів глютеліну, виявлених в рисі.

• два близькосхожих гени глютеліну розташовані спиною до спини на одній хромосомі.
• У LGC-1 між двома генами відбулася делеція, яка видаляє сигнал, який зазвичай зупиняє транскрипцію після першого гена.
• Таким чином РНК-полімераза II транскрибується прямо повз першого гена і далі в другий.
• В результаті виходить месенджерна РНК з майже однаковими послідовностями, що працюють в протилежних напрямках.
• Це призводить до того, що мРНК згортається в молекулу дволанцюгової РНК (dsRNA).
• Фермент, подібний до Dicer, скорочує dsRNA на невеликі інтерференційні РНК (sirNA), які пригнічують подальшу транскрипцію цих генів, а також інших генів глютеліну.

Чому РНІ?

Встановлено, що РНІ діє в таких різноманітних організмах, як рослини, гриби та тварини, такі як Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, і навіть миші та зебрариба. Така універсальна реакція клітини повинна мати важливу функцію. Що це може бути?

Деякі можливості:

• Деякі віруси як рослин, так і тварин мають геном дСРНК. І багато інших вірусів як рослин, так і тварин мають геном РНК, який в клітині-господаря ненадовго перетворюється в dsRNA. Тож РНК може бути зброєю для протидії інфекціям цими вірусами, знищуючи їх мРНК і тим самим блокуючи синтез основних вірусних білків.
• Транспозони можуть транскрибуватися в молекули РНК з областями, які є дволанцюжковими. RNAI потім може знищити їх.
• Інтерференція РНК може бути несподіваним дивідендом іншого основного процесу контролю експресії генів.

РНК як інструмент

У будь-якому випадку відкриття РНІ додає перспективний інструмент в інструментарій молекулярних біологів. Введення dsRNA, що відповідає певному гену, вибиває власну експресію клітини цього гена. (Годування C. elegans на E. coli, що виробляє dsRNA, навіть зробить трюк.)

Героїчний приклад

У випуску 24 березня 2005 року про природу, Sönnichsen et al повідомили, що вони ввели DSRNA, що відповідають 20,326 генів C. elegans (98% від загальної кількості!) і контролював вплив кожного на ембріональний розвиток від завершення мейозу (після запліднення) через другий мітотичний поділ, який виробляє 4-клітинний ембріон.

Вони виявили, що щонайменше 661 різних генів змінили певний процес протягом цього періоду:

• близько половини з них беруть участь в поділі клітин і
• половина в загальному метаболізмі клітин.

(Ще тисяча генів виробляли фенотипічні ефекти, які були помічені на більш пізніх стадіях розвитку.)

Оскільки РНІ можна робити в певних тканині в обраний час, це часто забезпечує перевагу перед звичайними генними «нокаутами», де відсутній ген переноситься в зародковій лінії і, таким чином, відсутність якого може вбити ембріон, перш ніж його можна буде вивчити.

Інший приклад: скринінг генів на предмет їх впливу на чутливість до ліків

• Розподіліть ваші клітини в тисячах лунок і додайте - з «бібліотеки» тисяч SiRNA, що представляють весь геном, - молекули SiRNA, орієнтовані на експресію одного гена в кожну лунку
• Додайте препарат у всі лунки.
• Подивіться, які свердловини мають клітини, які реагують

Деякі інші перспективні застосування РНІ

У клітині ссавців

У клітині ссавців введення фрагментів dsRNA лише тимчасово знижує експресію генів. Однак клітини ссавців можуть бути заражені вектором ДНК, який кодує молекулу РНК 50-80 нуклеотидів, званих «маленькою шпилькою РНК» (shRNA), що містить послідовність, відповідну гену, який хочеться придушити. Коли SHRNA синтезується, дісер перетворює її в типову молекулу SiRNA. Оскільки клітина може безперервно синтезувати SHRNA, інтерференція є тривалою. Насправді, з векторами, які інтегруються в геном господаря, РНІ можна передавати нащадкам.

У рослин

19 Червень 2003 року випуск Nature повідомив про кавові рослини, які були розроблені для вираження трансгену, який робить SiRNA, що перешкоджає - шляхом РНК - експресії гена, необхідного для виготовлення кофеїну. Так що, можливо, «без кофеїну» кави в один прекрасний день більше не зажадає хімічного видалення кофеїну з кавових зерен.

Monsanto розробляє трансгенну кукурудзу (кукурудзу), яка виражає dsRNA, що відповідає послідовності незамінного гена у західного кукурудзяного кореневого черв'яка, руйнівного шкідника врожаю. Після прийому цієї ДСРНК власні клітини комахи переробляють її в сиРНК, яка націлена на мРНК гена для знищення і вбиває хробака за кілька днів.

посилення РНК

У C. elegans, рослини, і Neurospora введення декількох молекул dsRNA має потужний і тривалий ефект. У рослин ген глушіння поширюється на сусідні клітини (через плазмодесмати) і навіть на інші частини рослини (через флоему). РНІ всередині клітини може тривати після мітозу в потомстві цієї клітини. Запуск РНІ в C. elegans може навіть пройти через зародкову лінію до своїх нащадків.

Таке посилення початкового тригерного сигналу говорить про каталітичний ефект. Виявляється, ці організми мають РНК-залежні РНК-полімерази (RDRP), які використовують мРНК, орієнтовану на початкову антисенсивну SiRNA, як шаблон для синтезу більшої кількості SiRNA. Синтез цих «вторинних» сирНК навіть відбувається в сусідніх областях мРНК. Таким чином, ці вторинні SirNA можуть не тільки націлювати на додаткові ділянки вихідної мРНК, але вони потенційно здатні замовчувати мРНК інших генів, які можуть нести ту ж послідовність нуклеотидів.

Це явище, зване «транзитивним РНІ»,

• може ускладнити інтерпретацію експериментів з придушення генів, оскільки експресія інших генів може бути придушена на додаток до гена-мішені;
• піднімає попереджувальний прапор щодо використання РНІ для придушення одиночних генів в терапії людини (хоча RDRP та ампліфікація не спостерігалися в клітині ссавців).

РНІ в терапії людини

Оскільки його мета настільки специфічна, можливість використання РНІ для припинення експресії одного гена створила велике хвилювання, що новий клас терапевтичних агентів знаходиться на горизонті. Багато клінічних випробувань ведуться з вивчення використання молекул SiRNA в лікуванні найрізноманітніших захворювань. На сьогоднішній день найбільш перспективними результатами було використання РНІ для націлювання на спадкове захворювання, при якому печінка виділяє мутантну форму транстиретину, що призводить до накопичення амілоїдних відкладень в нейроні та інших місцях.

МікроРНК (мікроРНК)

У C. elegans успішний розвиток через його личинкові стадії і далі до дорослої людини вимагає наявності щонайменше двох "мікроРНК" («miRNA») - одноланцюгових молекул РНК, що містять близько 22 нуклеотидів і, таким чином, приблизно такого ж розміру, як SirNA.

Ці невеликі однониткові стенограми генеруються розщепленням більших попередників за допомогою C. elegans версії Dicer.

Вони діють, знищуючи або гальмуючи трансляцію декількох месенджерних РНК у хробака (як правило, шляхом зв'язування з областю комплементарної послідовності в 3' неперекладеної області [3'-UTR] мРНК).

МікроРНК (miRNA) в C. elegans (які вперше називалися «малими скроневими РНК») виявляються представниками великого класу РНК, які кодуються власними генами організму.

• Початковим продуктом транскрипції генів є велика молекула під назвою pr i -miRNA.
• Перебуваючи в ядрі, фермент під назвою Дрошер розрізає PRI-miRNA на коротшу молекулу (~ 70 нуклеотидів), яка називається pr e -miRNA.
• Попередньо mIRNA експортується в цитозол, де він розщеплюється (Dicer у тварин) в miRNA.

МікроРНК

• зустрічаються у всіх тварин (люди генерують близько 1000 мРНК) і рослин, але не в грибах.
• містять 19-25 нуклеотидів;
• кодуються в геномі
  • деякі за допомогою автономних генів (які можуть кодувати кілька mIRNA)
  • деякі порціями інтрона гена, мРНК якого вони будуть регулювати.
• може виражатися в
  • тільки певні типи клітин і
  • тільки в певний час при диференціації певного типу клітин.

Хоча прямі докази функції багатьох з цих нещодавно відкритих генних продуктів ще належить виявити, вони регулюють експресію генів, регулюючи месенджерну РНК (мРНК), або

• знищення мРНК, коли послідовності точно збігаються (звичайна ситуація у рослин) або
• пригнічення його перекладу, коли послідовності є лише частковим збігом. У цьому останньому випадку, ймовірно, потрібно кілька mIRNA для одночасного зв'язування в 3'-UTR.

МікроРНК мають дві риси, які ідеально підходять для цього:

• Будучи такими маленькими, їх можна швидко транскрибувати зі своїх генів.
• Їх не потрібно переводити в білковий продукт, щоб діяти (на відміну, наприклад, до факторів транскрипції).

МікроРНК регулюють (пригнічують) експресію генів у ссавців, а також. Аналіз генома виявив тисячі генів людини, стенограми яких (m РНК) містять послідовності, до яких може зв'язуватися одна або кілька наших mi РНК. Ймовірно, кожна miRNA може зв'язуватися з цілими 200 різними мішенями мРНК, тоді як кожна мРНК має місця зв'язування для декількох мікроНК. Така система надає безліч можливостей для скоординованого перекладу мРНК.

Дослідження, про яке повідомляється в Nature (Lim, et al. , 433: 769, 17 лютого 2005) використовував аналіз ДНК чіпа, щоб показати, що коли конкретна miRNA була експресована в клітині HelA,

• а miRNA зазвичай виражається в мозку репресованої вироблення мРНК 174 різними генами в той час як
• а miRNA зазвичай виражається в серцевих і скелетних м'язах репресована вироблення мРНК 96 генами - всі, крім 8 з них відрізняються від тих, що пригнічуються міРНК мозку.

Оскільки робота швидко триває в цій галузі, закономірність, яка починає з'являтися, полягає в тому, що:

• Багато генів, особливо тих, хто бере участь у таких господарських заходах (наприклад, клітинне дихання), загальних для всіх клітин, не мають 3'-УТР, які можуть бути заблоковані будь-якою з мікроНК, закодованих у геномі.
• Гени, які повинні бути виражені в певному типі диференційованої клітини та/або в певний час життя цієї клітини
  • не виражають жодного з генів miRNA, які могли б блокувати їх експресію, але
  • експресують гени miRNA, які блокують експресію інших генів для спеціалізованих функцій, які не були б доречні в цій клітині в той час.
• Замість того, щоб бути простими перемикачами, які вмикають або вимикають експресію генів, мікроНК, здається, надають більш тонкий ефект - підвищення або зниження рівня експресії генів (так само, як це роблять фактори транскрипції білка).

Таким чином, репресія експресії генів мікроНК, здається, є механізмом забезпечення регульованої та скоординованої експресії генів, коли клітини диференціюються за певними шляхами. Наприклад, коли гени зиготи починають включатися в бластулу зебрафіша, один з них кодує miRNA, що викликає руйнування материнських мРНК, які до цього часу працювали.

Таким чином, miRNA можуть відігравати таку ж важливу роль, як фактори транскрипції в регулюванні та координації експресії декількох генів у певному типі клітин в певний час.

Лікувальні мікроНК?

Легкість, з якою miRNA можуть бути введені в клітини, та їх широкий вплив на експресію генів породили надії, що вони можуть бути корисними для боротьби з генетичними порушеннями, наприклад, раком.

На сьогоднішній день деякі лабораторні дослідження були досить перспективними.

• МіРНК, яка блокує експресію циклінів G ₁ та S-фази - і таким чином зупиняє клітинний цикл у своїх слідах - захищає мишей від раку печінки.
• miRNA, яка інгібує гени, необхідні для метастазування, пригнічує метастазування лікуваних клітин раку молочної залози людини.

Резюме

Окрім факторів транскрипції білка, еукаріоти використовують невеликі молекули РНК для регулювання експресії генів - майже завжди шляхом її придушення - тому явище називається глушінням РНК.

Існує два джерела малих молекул РНК:

• малі заважають РНК (siRNA s)
  • Рослинні клітини роблять їх з дволанцюгової РНК (DsRNA) вторгнення вірусів.
  • Вчені та фармацевтичні компанії роблять їх агентами для відключення експресії конкретних генів (званих інтерференцією РНК або РНК).
• мікро РНК (miRNA s)
  • Вони закодовані в геномах всіх рослин і тварин.
• І sirNA, і miRNA обробляються однаково в цитозолі клітини.
  • Обидва генеруються Dicer.
  • Обидва включені в R NA-, що вводиться як спонукання c комплексом (RISC).
    • Якщо нуклеотидна послідовність малої РНК точно збігається з послідовністю мРНК, мРНК розрізається і руйнується.
    • Якщо є лише часткове збіг (зазвичай у його 3' UTR), переклад (тобто синтез білка) пригнічується. Обидві ці дії відбуваються в цитозолі - можливо, в Р-тілах.
    • Однак для деяких малих РНК комплекс RISC потрапляє в ядро і відключає транскрипцію відповідного гена (ів) шляхом
      • зв'язування з розмотаною послідовністю ДНК (або, можливо, стенограмою РНК у міру її формування)
      • перетворення еухроматину в гетерохромацію
      • метилювання лізину-9 гістону H3 в нуклеосомах навколо гена (ів)

Окрім їх використання в якості лабораторних - і, можливо, терапевтичних - інструментів, невеликі РНК явно необхідні організмам, які їх виробляють.

Деякі приклади:

• Рослини і тварини використовують їх для захисту від вірусів.
  • Приклад: Коли клітини людини інфіковані вірусом гепатиту С (HCV), вони виробляють мікроНК, які перешкоджають експресії генів цим вірусом РНК і, отже, його здатності до реплікації.
• Деякі герпесвіруси використовують їх, щоб зберегти свою клітину-господаря живими досить довго, щоб завершити вірусну реплікацію (притупляючи імунну відповідь господаря проти зараженої клітини та запобігаючи її передчасній загибелі апоптозом).
• З 46 мікроНК, виражених у ембріоні дрозофіли, 25 були показані важливими для нормального розвитку.
• Правильний ембріональний розвиток у інших тварин (наприклад, C. elegans, zebrafish, мишей) також вимагає їх.
• Вони захищають від небезпеки мутацій, викликаних транспозонами, що рухаються в геномі.
• Вони також необхідні для регулювання розміру пулу хоча б деяких видів стовбурових клітин.
• Трансгенні миші з одним вибитим геном miRNA розвивають важкий імунодефіцит, що впливає на дендритні клітини, помічники Т-клітини та В-клітини.
• Знижена, чи ні, експресія певних мікроНК характерна для декількох різних видів раку у людини.