11.4: Останні досягнення в генній терапії

Last updated
Save as PDF

Page ID: 5869

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Досягнення мети ефективної генної терапії захворювань людини було важким. Деякі проблеми, які ще належить вирішити, включають:

як уникнути імунної відповіді у пацієнта, який може заважати генної терапії двома способами:
- Вектор провокує запалення.
- Вектор виділяє антитіла, які руйнують вектор при повторному введенні.
Обидва вони є серйозними проблемами з аденовірусними переносниками.
як отримати ген в не діляться клітини, такі як печінка, м'язи та нейрони;
як отримати ген для реплікації (в ділильних клітині) і виражений нескінченно, але
мінімізувати ризик того, що він вставляє поблизу протоонкогена, який він може активувати, виробляючи рак. (Це сталося у кількох маленьких хлопчиків, які лікувалися ретровірусним вектором на основі вірусу лейкемії мишей.
як змусити ген бути експресований в міру необхідності; тобто як привести ген під нормальний фізіологічний контроль, щоб його продукт вироблявся де, коли, і в необхідних кількостях.

Адено-асоційований вірус (AAV) - можливе рішення?

Аденоасоційований вірус отримує свою назву тому, що часто зустрічається в клітині, які одночасно заражені аденовірусом. Однак сам по собі він здається нешкідливим. На відміну від аденовірусу, ААВ

не стимулює запалення у господаря;
можуть надходити не діляться клітини;
успішно інтегрується в одну пляму в геномі свого господаря — на хромосомі 19 у людини.
(Однак вектори AAV викликають сильну імунну відповідь, тому їх можна використовувати лише один раз.)

Що стосується проблеми отримання трансгена, щоб бути виражений належним чином, це може бути вирішено за допомогою двох векторів AAV одночасно:

один, що несе бажаний ген (наприклад, для фактора VIII або аденозиндеамінази, або у випадку, проілюстрованому тут, еритропоетину) в клітини господаря;
інші несучі гени для компонентів факторів транскрипції, необхідних для включення цього гена.

Регульована продукція еритропоетину (ЕПО)

Вектор 1

Цей шматок ДНК містив (серед іншого):

ДНК аденоасоційованого вірусу (ААВ)
ген, що кодує білок, що містить два домени:
- частина молекули (» p65 «), яка необхідна для активації транскрипції генів, але сама по собі не може зв'язуватися з ДНК
- порція (» FRB «), яка пов'язує препарат рапаміцин.
ген, що кодує інший білок з двома доменами:
- частина молекули (» ZFHD1 «), яка зв'язується конкретно з послідовністю ДНК в промоторі гена еритропоетину, але сама по собі не може активувати транскрипцію гена;
- порція (» FKBP12 «), яка також зв'язується з рапаміцином.
промоутери (не показані), які дозволяють безперервну експресію (транскрипцію та переклад) двох генів. Але зауважте, що самі по собі два генних продукту є неактивними.

Вектор 2

Цей шматок ДНК містив (серед іншого):

ДНК аденоасоційованого вірусу (ААВ)
12 однакових промоторів (зелених коробок) гена еритропоетину
сам ген еритропоетину (ЕПО)

Експеримент

Експериментальним тваринам вводили (в їх скелетні м'язи) багато копій обох векторів. Скелетна мускулатура була обрана тому, що м'язові волокна багатоядерні. Опинившись через плазмову мембрану, є багато ядер, в які можуть увійти вектори і, отже, багато можливостей інтегруватися в ДНК господаря.

Пізніше тваринам вводили рапаміцин. Ця мала молекула є імунодепресантом і в даний час тестується у реципієнтів трансплантатів, щоб допомогти їм уникнути відторгнення трансплантата. Він був використаний тут через свою здатність одночасно зв'язуватися з доменами FRB і FKBP12 двох генних продуктів вектора 1. Отриманий тример є активним фактором транскрипції для гена еритропоетину.

Результати

У мишей

Ін'єкції двох векторів не мали — самі по собі — ніякого впливу ні на вироблення ЕПО, ні на кількість еритроцитів (гематокрит), але кожен раз, коли цим тваринам робили ін'єкцію рапаміцину, вони швидко почали виробляти ЕПО (з підвищенням рівня в 100 разів) і зросла кількість еритроцитів (гематокрити збільшилися з 42% до 60%). Кількість виробленого ЕПО була безпосередньо пов'язана з кількістю наданого рапаміцину. Навіть через 5 місяців одноразова ін'єкція рапаміцину спричинила різке підвищення рівня ЕПО в крові.

У мавп

Результати були схожі на результати у мишей, але ефект зносився через 4 місяці. Отже, ось система, в якій ген, введений тварині, потім можна включити, надаючи тварині невелику молекулу. (У людей рапаміцин можна давати через рот як таблетку.) І його вихід може регулюватися кількістю введеної невеликої молекули.

Лікування інсулінозалежного цукрового діабету (IDDM) у мишей та щурів

Дослідники в Сеулі, Корея повідомили у випуску «Природа» 23 листопада 2000 року, що вони використовували вектор типу AAV для лікування

миші з успадкованим IDDM (тваринний еквівалент цукрового діабету 1 типу у людини)
щурів з IDDM, індукованих хімічним руйнуванням їх інсулінсекретуючих бета-клітин

Обидві групи тварин вводили (в їх печінкову ворітну вену) мільярди копій складного вектора, що містить:

ААВ
комплементарна ДНК (кДНК), що кодує синтетичну версію інсуліну
промотор, який активний тільки в клітині печінки і включається наявністю глюкози
ДНК, що кодує послідовність сигналу (так що інсулін може виділятися)
підсилювач для підвищення експресії цього штучного гена

Результати:

Обидві групи тварин отримали контроль над рівнем цукру в крові і зберігали цей контроль понад 8 місяців. Коли дають глюкозу, вони приступили до синтезу синтетичного інсуліну, який потім привів глюкозу в крові до нормального рівня.

Лікування гемофілії В у мишей

Дослідники Інституту Салка повідомили (у випуску 30 березня 1999 року Праці Національної академії наук) роботу з мишами

чиї гени фактора згортання IX були «вибиті» і
Таким чином, були схильні до неконтрольованих кровотеч, як пацієнти людини з гемофілією В.

Цим мишам вводили (також у печінкову ворітну вену) ДНК, що містить

ААВ
кДНК фактора IX (ген собаки)
специфічні для печінки послідовності промоторів та підсилювачів

Миші продовжували робити фактор IX і більше не були сприйнятливі до неконтрольованої кровотечі.

У пізніших роботах ін'єкція ембріональних стовбурових клітин з генами фактора IX функціонування в печінку мишей без вилікуваних генів.

лікування БАС

БАС (міотрофічний l бічний s клероз) - це захворювання людини, при якому рухові нейрони дегенерують. (Його часто називають «хворобою Лу Геріга» після того, як помер від неї бейсболіст.)

Подібне захворювання може бути створено у трансгенних мишей, що несуть мутантні гени людини (для супероксиддисмутази), пов'язані з БАС.

Дослідники в Інституті Солка уповільнили прогресування захворювання у цих мишей шляхом ін'єкції їх скелетних м'язів з AAV вектор, що містить ген для інсуліноподібний фактор росту 1 (IGF-1). Вектор

вторглися в м'язові клітини
перемістилися в прикріплені до них рухові нейрони і
через свої аксони до тіл клітин

Результати:

Знищення рухових нейронів скоротилося, і миші жили довше, ніж мали б в іншому випадку.

Перспективи

Це великий стрибок від мишей до людини, але ці результати свідчать про те, що принцип генної терапії одногенних розладів є дійсним.

І деякі ранні випробування на людях виглядають багатообіцяючими.

Внутрішньовенна ін'єкція вектора ААВ, що містить кДНК фактора IX, спричинила функціональні рівні фактора IX у кількох чоловіків з гемофілією В.
18 серпня 2003 року медики Нью-Йорка ввели 3,5 х 10 ⁹ копій вектора AAV, що несе ген для синтезу ГАМК в мозок пацієнта з хворобою Паркінсона. Він був першим клінічним випробуванням першої фази цієї процедури. До 2007 року ще кілька пацієнтів Паркінсона лікувалися цими ін'єкціями без шкідливих побічних ефектів і деякого поліпшення їх симптомів.
Кілька пацієнтів з успадкованою відсутністю функціонального гена, необхідного для синтезу 11- цис-сітківки - і, таким чином, судилося бути сліпим - мали корисний рівень зору, тимчасово відновлений в одному оці, введеному вектором AAV, що містить ген (інше око було необробленим контролем). Ймовірно, той факт, що
- вектор вводився безпосередньо в око і так не розбавлявся по всьому тілу, як внутрішньовенна ін'єкція була б;
- клітини сітківки рідко діляться, щоб вектор не був втрачений. (Використовуваний вектор мав гени, необхідні для інтеграції в ДНК клітини-господаря, щоб він не міг бути продубльований у фазі S, і в ділильних клітині зрештою зникне.)
- внутрішня частина ока - імунологічно привілейований сайт
сприяв цьому неабиякий успіх.
Кілька дітей, які страждають на Х-зчеплений важкий комбінований імунодефіцит, відновили імунну систему після ретровірусної генної терапії.
Кілька пацієнтів з гемофілією А показали помірне поліпшення при введенні власних клітин, які раніше були зібрані і трансформовані in vitro з плазмідою, що містить ген фактора VIII.
Кілька агентів генної терапії - з використанням аденовірусних векторів - знаходяться в клінічних випробуваннях і показали певну перспективність.
Серед них:
- рекомбінантний аденовірус, що кодує p53, пухлино-супресорний білок, відсутній у багатьох ракових захворюваннях
- рекомбінантний аденовірус, який руйнує клітини, які не мають білка p53 (як багато ракових клітин роблять)

Люди з рідкісним розладом дефіциту ліпопротеїнліпази не в змозі обробляти глобули (хіломікрони) жиру та білка, які з'являються в крові після жиросодержащей їжі, оскільки їм не вистачає функціональних копій гена, що кодує ліпопротеїнліпазу. Внутрішньом'язова ін'єкція вектора ААВ, що містить функціональний ген, забезпечує достатнє поліпшення, з очевидною безпекою, що в жовтні 2012 року цей засіб (Glybera®) отримав схвалення для застосування в Європейському Союзі. Це перша генна терапія, яка отримала таке схвалення.