11.1: Рекомбінантна ДНК та клонування генів

Last updated
Save as PDF

Page ID: 5841

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Рекомбінантна ДНК - це ДНК, яка була створена штучно. ДНК з двох і більше джерел включена в одну рекомбінантну молекулу.

Створення рекомбінантної ДНК (рДНК) - огляд

Лікують ДНК з обох джерел з однаковою рестрикцією ендонуклеази (BamHi в даному випадку).
BamHi розрізає один і той же сайт на обох молекулах

5' ГАТЧ
3' КУТАГ 5'

Кінці зрізу мають нависає шматок однониткового ДНК.
Вони називаються «липкими кінцями», оскільки вони здатні створити пару з будь-якою молекулою ДНК, що містить додатковий липкий кінець.
У цьому випадку обидва препарати ДНК мають доповнюючі липкі кінці і, таким чином, можуть з'єднуватися один з одним при змішуванні.
ДНК-лігаза ковалентно пов'язує їх у молекулу рекомбінантної ДНК.

Щоб бути корисним, рекомбінантна молекула повинна бути реплікована багато разів, щоб забезпечити матеріал для аналізу, секвенування тощо Виробництво багатьох однакових копій однієї і тієї ж рекомбінантної молекули називається клонуванням. Клонування може здійснюватися in vitro шляхом процесу, який називається полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР). Тут, однак, ми розглянемо, як клонування робиться in vivo.

Клонування in vivo можна зробити в

одноклітинні мікроби, як кишкова паличка
одноклітинні еукаріоти, такі як дріжджі і
в клітині ссавців, вирощених в культурі тканин.

У кожному випадку рекомбінантна ДНК повинна бути прийнята клітиною у формі, в якій вона може бути реплікована та виражена. Це досягається шляхом включення ДНК в вектор. Переносниками може служити ряд вірусів (як бактеріальних, так і клітин ссавців). Але тут давайте розглянемо приклад клонування з використанням кишкової палички як господаря і плазміди як вектора.

Плазміди

Плазміди невеликі (кілька тисяч пар основ), зазвичай несуть лише один або кілька генів, кругові і мають єдине походження реплікації. Плазміди тиражуються тим же механізмом, який реплікує бактеріальну хромосому. Деякі плазміди копіюються приблизно з тією ж швидкістю, що і хромосома, тому одна клітина здатна мати лише одну копію плазміди. Інші плазміди копіюються з високою швидкістю, і в одній клітині може бути 50 і більше їх.

Гени на плазмідах з великою кількістю копій зазвичай виражаються на високих рівнях. У природі ці гени часто кодують білки (наприклад, ферменти), які захищають бактерію від одного або декількох антибіотиків. Плазміди потрапляють в бактеріальну клітину з відносною легкістю. Це відбувається в природі і може пояснити швидке поширення антибіотикорезистентності в лікарнях та інших місцях. Плазміди можуть бути навмисно введені в бактерії в лабораторії, перетворюючи клітину з надходять генами.

На наведеному вище малюнку клубок - це частина однієї молекули ДНК, що містить понад 4,6 мільйона пар основ, що кодують приблизно 4300 генів. Маленькі кола - плазміди.

Приклади плазмід

ПАМП

4539 пар бази
єдине походження реплікації
ген (amp ^r), що надає стійкість до антибіотика ампіциліну (родич пеніциліну)
одиничне входження послідовності

5' GGATCC 3'
3' CCTAGG 5'що, як ми бачили вище, скорочується рестрикційним ферментом BamHi

одиничне входження послідовності

5' AAGCTT 3'
3' TTCGAA 5', який скорочується рестрикційним ферментом HindiII

Обробка PAMP сумішшю BamHi і HindiIII виробляє:

фрагмент 3755 пар основ, що несуть як ген amp ^r, так і походження реплікації
фрагмент з 784 пар основ
обидва фрагменти мають липкі кінці

Пкан

4207 пар бази
єдине походження реплікації
ген (кан ^р), що надає стійкість до антибіотика канаміцин.
єдиний сайт, вирізаний BamHi
єдиний сайт, вирізаний HindiIII

Лікування ПКК сумішшю БаМХі і ХіндіIII виробляє:

фрагмент з 2332 пар основ
фрагмент 1875 пар основи з геном kan ^r (але не походження реплікації)
обидва фрагменти мають липкі кінці

Ці фрагменти можна візуалізувати, піддаючи травні суміші електрофорезу в агарозному гелі. Через свої негативно заряджені фосфатні групи ДНК мігрує до позитивного електрода (анода) при подачі постійного струму. Чим менше фрагмент, тим далі він мігрує в гелі.

Можливості лігування

Якщо видалити два рестрикційних ферменти і забезпечити умови для ДНК-лігази для виконання своєї роботи, шматки цих плазмід можуть знову приєднатися (завдяки взаємодоповнюваності їх липких кінців).

Змішування фрагментів PKaN і PAMP забезпечує кілька (принаймні 10) можливостей повторних з'єднаних молекул. Деякі з них не будуть виробляти функціональні плазміди (молекули з двома або без реплікації походження не можуть функціонувати).

альт

Рис.11.1.4 Рекомбінантна плазміда

Одна цікава можливість - приєднання

фрагмент PAMP 3755-bp (з підсилювачем ^r та початком реплікації) з
1875-bp Фрагмент ПКана (з кан ^р)

Запечатані ДНК-лігазою, ці молекули є функціонуючими плазмідами, які здатні надавати стійкість як ампіциліну, так і до канаміцину. Вони являють собою молекули рекомбінантної ДНК.

Оскільки походження реплікації, яке дозволяє молекулі функціонувати як плазміда, сприяло PAMP, PAMP називається вектором.

Перетворення кишкової палички

Лікування кишкової палички сумішшю релігірованих молекул дасть деякі колонії, які здатні рости в присутності як ампіциліну, так і канаміцину.

Суспензію кишкової палички обробляють сумішшю релігірованних молекул ДНК.
Суспензію викладають на поверхню агару, що містить як ампіцилін, так і канаміцин.
Наступного дня кілька клітин, стійких до обох антибіотиків, виростуть у видимі колонії, що містять мільярди перетворених клітин.
Кожна колонія являє собою клон перетворених клітин.

Однак кишкова паличка може одночасно трансформуватися більш ніж однією плазмідою, тому ми повинні продемонструвати, що трансформовані клітини придбали рекомбінантну плазміду.

Електрофорез ДНК з подвійно стійких колоній (клонів) розповідає історію.

Плазмідна ДНК з клітин, які придбали свою стійкість від рекомбінантної плазміди, показують лише смуги 3755 -bp та 1875 -bp (Clone 1, провулок 3).
Клон 2 (Lane 4) був одночасно перетворений релігійними PAMP і PKAN. (Ми не можемо сказати, чи взяв він і рекомбінантну молекулу.)
Клон 3 (провулок 5) був перетворений рекомбінантною молекулою, а також інтактною PKAN.

Клонування інших генів

Описаний вище рекомбінантний вектор сам по собі може бути корисним інструментом для клонування інших генів. Припустимо, що в межах його гена резистентності до канаміцину (kan ^r) існує єдине виникнення послідовності

5' ГАТЦ 3'
3' КІТТАГ 5'

Це розрізається рестрикційним ферментом eCori, виробляючи липкі кінці.

Якщо ми обробляємо будь-який інший зразок ДНК, наприклад, з клітин людини, за допомогою eCori, утворюються фрагменти з такими ж липкими кінцями. Змішана з обробленою Екорі плазмідою та ДНК-лігазою, невелика кількість людських молекул буде включена в плазміду, яка потім може бути використана для перетворення кишкової палички.

Але як виявити ті клони кишкової палички, які були перетворені плазмідою, що несе шматок людської ДНК?

Ключовим є те, що сайт eCORI знаходиться в гені kan ^r, тому, коли туди вставляється шматок людської ДНК, функція гена руйнується.

Всі клітини кишкової палички, трансформовані вектором, незалежно від того, несе він ДНК людини чи ні, можуть рости в присутності ампіциліну. Але клітини кишкової палички, перетворені плазмідою, що несе ДНК людини, не зможуть рости в присутності канаміцину. Отже,

Нанесіть суспензію обробленої кишкової палички на агар, що містить тільки ампіцилін
ростуть за ніч
стерильною зубочисткою перенести невелику кількість кожної колонії на виявлене місце на агарі, що містить канаміцин
(Виконайте те ж саме з іншою ампіциліновою пластинкою)
Інкубувати на ніч

Усі ті клони, які продовжують рости на ампіциліні, але не ростуть на канаміцині (тут клони 2, 5 та 8), були перетворені шматочком людської ДНК.

Деякі рекомбінантні продукти ДНК, що використовуються в терапії людини

Використовуючи подібні процедури, багато генів людини були клоновані в кишковій паличці або в дріжджах. Це дозволило вперше виробляти необмежену кількість людських білків in vitro. Культурні клітини (кишкова паличка, дріжджі, клітини ссавців), трансформовані геном людини, використовуються для виробництва понад 100 продуктів для терапії людиною. Деякі приклади:

інсулін для діабетиків
фактор VIII для чоловіків, які страждають на гемофілію А
фактор IX при гемофілії В
гормон росту людини (HGH)
еритропоетин (ЕПО) для лікування анемії
кілька видів інтерферонів
кілька інтерлейкінів
Гранулоцитарно-макрофаговий колонієстимулюючий фактор (GM-CSF) для стимуляції кісткового мозку після трансплантації кісткового мозку
Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF) для стимуляції вироблення нейтрофілів (наприклад, після хіміотерапії) і для мобілізації гемопоетичних стовбурових клітин з кісткового мозку в кров.
тканинний активатор плазміногену (ТПА) для розчинення тромбів
аденозиндеаміназа (АДА) для лікування деяких форм важкого комбінованого імунодефіциту (SCID)
паращитовидний гормон
багато моноклональних антитіл
поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg) для вакцинації проти вірусу гепатиту В
Інгібітор С1 (C1INH) використовується для лікування спадкового набряку Квінке