16.5: Грунт-вибух
- Page ID
- 6525
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
Грунтовка-вибух являє собою комбінацію програми під назвою Primer3, яка допомагає в розробці грунтовки з конкретними властивостями і BLAST. Праймер-бласт дозволяє будувати праймери для QPCR, де користувач може вказати температуру плавлення, зменшити кількість самовсмоктуючих та пролітати екзон-екзонові переходи, щоб уникнути ампліфікації забруднюючої геномної ДНК. Після проектування праймерів кожна пара праймерів відправляється в BLAST, щоб визначити, чи будуть також заґрунтовані та посилені подібні продукти в геномі модельного організму. Цей процес гарантує, що розроблені праймери підпадають під ваші проектні параметри і, швидше за все, лише підсилюють ваш цікавий ген.
- Введіть послідовність АБО номер приєднання NCBI для цікавить гена.
- Визначте довжину продукту ПЛР.
- Обмеження продукту між 100-500 дозволяє забезпечити хорошу ефективність у QPCR.
- Довші продукти не можуть бути ефективно репліковані залежно від вашого велосипедного протоколу.
- Визначте бажану температуру плавлення (Т м) праймерів (мінімальна, оптимальна, максимальна, різниця між встановленими).
- 60ºC є досить високим і допоможе в підвищеній специфічності грунтовки з мішенню під час посилення, щоб уникнути помилкового грунтування.
- Намагайтеся мати T m якомога ближче, щоб вони відпалювали приблизно однаково.
- Виберіть варіант «Грунтовка повинна охоплювати екзон-екзон-стик».
- Це допомагає ампліфікувати кДНК, а не геномну ДНК, яка може забруднювати.
- Не вибирайте це, якщо це єдиний ген ексона, оскільки це не вдасться.
- Виберіть Refseq мРНК як базу даних для пошуку.
- Refseq надає послідовності для послідовностей, що зустрічаються в природі.
- Такі речі, як плазмідні послідовності або векторні конструкції, не відображаються в Refseq.
- Виберіть організм, проти якого ви підриваєте.
- Існують варіанти модельних організмів, а також клітинних ліній.
- Якщо ви використовуєте щось на зразок клітин PC12, ви можете використовувати геном Rattus norvegicus або PC12, оскільки це також варіант у базі даних.
- Оцініть розташування праймерів і інші параметри. Зазвичай ми вибираємо праймери на 3′ кінці РНК, оскільки реакції RT часто мають 3′ зміщення в еукаріотів, використовуючи грунтування Oligo-DT у зворотній транскрипції.
