16.5: Грунт-вибух

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 16.4: У кремнієвій ПЛР
- 16.6: Морфометичний аналіз

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Грунтовка-вибух являє собою комбінацію програми під назвою Primer3, яка допомагає в розробці грунтовки з конкретними властивостями і BLAST. Праймер-бласт дозволяє будувати праймери для QPCR, де користувач може вказати температуру плавлення, зменшити кількість самовсмоктуючих та пролітати екзон-екзонові переходи, щоб уникнути ампліфікації забруднюючої геномної ДНК. Після проектування праймерів кожна пара праймерів відправляється в BLAST, щоб визначити, чи будуть також заґрунтовані та посилені подібні продукти в геномі модельного організму. Цей процес гарантує, що розроблені праймери підпадають під ваші проектні параметри і, швидше за все, лише підсилюють ваш цікавий ген.

Введіть послідовність АБО номер приєднання NCBI для цікавить гена.
Визначте довжину продукту ПЛР.
1. Обмеження продукту між 100-500 дозволяє забезпечити хорошу ефективність у QPCR.
2. Довші продукти не можуть бути ефективно репліковані залежно від вашого велосипедного протоколу.
Визначте бажану температуру плавлення (Т _м) праймерів (мінімальна, оптимальна, максимальна, різниця між встановленими).
1. 60ºC є досить високим і допоможе в підвищеній специфічності грунтовки з мішенню під час посилення, щоб уникнути помилкового грунтування.
2. Намагайтеся мати T _m якомога ближче, щоб вони відпалювали приблизно однаково.
Виберіть варіант «Грунтовка повинна охоплювати екзон-екзон-стик».
1. Це допомагає ампліфікувати кДНК, а не геномну ДНК, яка може забруднювати.
2. Не вибирайте це, якщо це єдиний ген ексона, оскільки це не вдасться.
Виберіть Refseq мРНК як базу даних для пошуку.
1. Refseq надає послідовності для послідовностей, що зустрічаються в природі.
2. Такі речі, як плазмідні послідовності або векторні конструкції, не відображаються в Refseq.
Виберіть організм, проти якого ви підриваєте.
1. Існують варіанти модельних організмів, а також клітинних ліній.
2. Якщо ви використовуєте щось на зразок клітин PC12, ви можете використовувати геном Rattus norvegicus або PC12, оскільки це також варіант у базі даних.
Оцініть розташування праймерів і інші параметри. Зазвичай ми вибираємо праймери на 3′ кінці РНК, оскільки реакції RT часто мають 3′ зміщення в еукаріотів, використовуючи грунтування Oligo-DT у зворотній транскрипції.