6.3: Зв'язування ліганду

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 6.2: Кінетика ферментів
- 6.4: Картування обмежень

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Молекулярне розпізнавання є ключовим аспектом практично всієї біохімії і передбачає:

Реплікація ДНК
Генна регуляція
Транскрипція ДНК в мРНК
Переклад мРНК в білки
Функція ферменту
Молекулярна збірка
Трансдукція сигналу
Клітинно-клітинний зв'язок
Імунологія

Міжмолекулярні взаємодії, в найпростішому прикладі, включають дві молекули, які розпізнають і зв'язуються один з одним:

ліганд
рецептор

Це широкі терміни, але загальні властивості рецептора і ліганду такі:

Ліганд, як правило, є невеликою молекулою, і він дифундує по всьому навколишньому середовищу, поки не зв'язується з певним рецептором
Рецептор, як правило, являє собою велику, відносно стаціонарну молекулу, яка містить специфічне місце зв'язування ліганду. При зв'язуванні ліганду структурні та/або хімічні властивості рецептора зазвичай змінюються

Взаємодія між рецептором і лігандом, як правило, не ковалентна

Існує загальна молекулярна комплементарність між рецептором і лігандом.
Часто, але не завжди, існує ентропна вартість, пов'язана з зв'язуванням ліганду з рецептором, але це з лишком компенсується сприятливою ентальпією (тобто молекулярною компліментарністю)
Енергія зв'язування, як правило, використовується, щоб викликати структурні зміни, пов'язані з подією молекулярного зв'язку.

Існує два загальні методи дослідження взаємодій рецепторів/лігандів:

1. Рівноважна термодинаміка, і
2. Кінетика асоціації та дисоціації

Аналіз рівноважного зв'язування ліган/рецепторів

Два можливих стану взаємодії ліга/рецепторів та константи швидкості, пов'язані з їх утворенням, наведені як:

захоплення 6.PNG

Константа рівноваги асоціації (освіти), K _f, задається як:

захоплення 8.PNG

[RL] - концентрація комплексу, [R] - концентрація вільного R при рівновазі, а [L] - концентрація вільного L при рівновазі
K _f має одиниці М ^-1
Велике значення для K _f означає, що рівновага сприяє комплексу - спостерігається висока спорідненість рецептора до ліганду
Невелике значення для K _f означає, що рівновага сприяє поділу рецептора і ліганду, а рецептор має низьку спорідненість до ліганду.

Просто для того, щоб ускладнити життя, типовою рамкою відліку при описі спорідненості рецепторів до ліганду є посилання на константу дисоціації, K _d:

K _d має одиниці М
Невелике значення для K _d означає, що рівновага сприяє комплексу - спостерігається висока спорідненість рецептора до ліганду
Велике значення для K _d означає, що рівновага сприяє поділу рецептора і ліганду, а рецептор має низьку спорідненість до ліганду

При рівновазі швидкість утворення комплексу RL дорівнює швидкості дисоціації:

Лівий вираз - це визначення константи дисоціації, K _d, отже:

Вираз вільної енергії і K _f і K _d

З початкового вираження складного освіти:

Стандартна зміна вільної енергії стану, Δ G ⁰, для процесу (тобто починаючи з 1M все) буде дано як:

Оскільки K _d - обернене K _f:

У цьому випадку від'ємне значення для DG ⁰ (що вказує на спонтанність) виникне, коли K _d < 1,0. Це станеться, коли є висока спорідненість і рівновага сприяє складному утворенню.

Практичні зв'язки між [R], [L], K _d і [RL]

При однаковій концентрації доданого ліганду і рецептора буде відбуватися більш складне утворення при меншому значенні K _d

Приклад 6.3.1

Рецептор і ліганд додають до загальної концентрації 1,0 х 10 ^-4 М. K _d для комплексу RL становить 1,0 х 10 ^-4 М. Яка концентрація [R], [L] і [RL] при рівновазі?

Знімок екрана (429) .png

Доданий ліганд, L, буде розділений між вільною та зв'язаною формами:

L _всього = Л + РЛ = 1,0 х 10 ^-4 М

Д = 1,0 х 10 ^-4 М - РЛ

Аналогічно, доданий рецептор, R, буде розділений між вільною та пов'язаною формами:

R _всього = R + RL = 1,0 х 10 ^-4 М

R = 1,0 х 10 ^-4 М - РЛ

Підстановка цих значень L і R у вираз для K _d дає:

Скріншот (430) .png

Це квадратика зі значеннями a = 1, b = -3,0 х 10 ^-4 і c = 1,0 х 10 ^-8. Це дає два можливі значення для RL:

RL = 2,62 Х 10 ^-4 М або

РЛ = 3,82 Х 10 ^-5

Оскільки максимально можливе значення для [RL] становить 1,0 х 10 ^-4 (тобто, враховуючи початкові концентрації R і L, це найбільша кількість RL, яка може бути сформована), перший результат неможливий і [RL] = 3,82 X 10 ^-5 M

Так, 38,2% доданого рецептора знаходиться в комплексоутворенні (тобто 3,82 Х 10 ^-5 М/1,0 х 10 ^-4) х 100%

Приклад 6.3.2

Така ж кількість доданих R і L, але на цей раз K _d для комплексу RL становить 1,0 х 10 ^-6 М. Яка концентрація [R], [L] і [RL] при рівновазі?

Знімок екрана (431) .png

це квадратика зі значеннями a = 1, b = -2,01 х 10 ^-4 і c = 1,0 х 10 ^-8. Це дає два можливі значення для RL:

RL = 1,11 Х 10 ^-4 М або

РЛ = 9,05 Х 10 ^-5

Так, 90,5% доданого рецептора знаходиться в комплексоутворенні (тобто 9,05 Х 10 ^-5 М/1,0 х 10 ^-4) х 100%

Визначення констант дисоціації (K _d) або зв'язування (K _f)

Співвідношення між K _d, [R], [L] і [RL] задається:

захоплення 9.PNG

Це рівняння з чотирма змінними, якщо ви знаєте три з них, ви можете вирішити для четвертої
В принципі, ви можете вирішити для K _d, якщо ви знаєте концентрацію вільного рецептора [R], вільного ліганду [L] і рецептора/лігандного комплексу [RL] при рівновазі

Щоб мати можливість вирішити для K _d, вам потрібен аналіз, який забезпечить молярні концентрації для кожного компонента. Однак цього, як правило, важко досягти. Набагато частіше є аналіз, який надасть вам інформацію щодо частки доданого рецептора (або ліганду), який присутній у вільній або складній формі.

Якщо [R _t] - загальна концентрація рецептора в зразку, ми знаємо, що він буде розділений на дві популяції - зв'язані і вільні:

Фракція пов'язаних рецепторних сайтів задається співвідношенням:

Фракція зв'язаних рецепторів відома змінною a, а має значення від 0 до 1

Захоплення 12.PNG

Підставляючи значення на [R _t] в терміні [R] та [RL], наведених вище, дає:

Зв'язок між [RL] і K _d задається виразом для Kd:

Цей вираз для [RL] можна підставити у вираз для a to yield:

Спростіть, попередньо розділивши через [R]:

Потім множимо на K _d:

Захоплення 17.PNG

Це рівняння має три змінні:

Концентрація вільного ліганду при рівновазі [L]
Константа дисоціації, K _d, для комплексу RL
Фракція рецептора, яка знаходиться в зв'язаній формі при рівновазі, а

Якщо ви знаєте дві з цих змінних, ви можете вирішити для третьої (тобто якщо експериментальний аналіз кількісно [L] і a, ви можете вирішити для K _d)

Вищевказаним рівнянням можна маніпулювати далі шляхом підстановки значення a через [RL] і [R _t]:

Це рівняння має чотири змінні:

Концентрація вільного ліганду при рівновазі [L]
Константа дисоціації, K _d, для комплексу RL
Концентрація рецептора, що знаходиться в зв'язаній формі при рівновазі [RL]
Загальна концентрація рецептора в зразку

Зазвичай експеримент з зв'язування лігандів налаштований таким чином, що [Rt] тримається постійною, а [RL] контролюється як функція [L]

Це рівняння дуже схоже на рівняння Міхаеліса-Ментена:

Побудова V проти [S] в рівнянні М-М дає прямокутну гіперболу. Таким чином, побудова графіка [RL] проти [L] також дасть прямокутну гіперболу

Асимптота кривої дасть значення [R _t]
Концентрація вільного ліганду [L], що призводить до половини максимального значення [RL], дорівнює значенню K _d

Ще одна модифікація полягає в тому, щоб зрозуміти, що якщо a дорівнює частці рецептора, пов'язаного в комплексі (зі значенням 0 ≤ α ≤ 1,0), то (1 - α) є часткою вільного рецептора (тобто фракції незв'язаного рецептора)

Знімок екрана (432) .png

Це значення можна підставити в три змінні вирази вище:

Знімок екрана (433) .png

Це рівняння має чотири змінні:

Концентрація вільного ліганду при рівновазі [L]
Константа дисоціації, K _d, для комплексу RL
Концентрація рецептора, що знаходиться у вільній формі при рівновазі [R]
Загальна концентрація рецептора в зразку [R _t]

Зазвичай експеримент з зв'язування лігандів налаштований таким чином, що [Rt] тримається постійною, а [R] контролюється як функція [L]

(Примітка: Хоча це виглядає як рівняння М-М, K _d є постійною.)

Наведені вище похідні називаються "зв'язуючими ізотермами" у зв'язку з їх здатністю вирішувати для Kd в умовах рівноваги (і вихідне рівноважне термодинамічне рівняння використовується постійна температура)

Знімок екрана (434) .png

Побудова даних для різних значень [L], [R _t], і або [RL] або [R], і підгонка до відповідної функції вище, дозволяє більш точно визначити K _d (хоча один експеримент дасть відповідь).

Через схожість графіка [RL] проти [L] з графіком М-М, це часто є більш бажаною експериментальною установкою. Зокрема, для більш точного визначення K _d може бути використаний подвійно-зворотний графік (так само, як і двозворотний М-М графік)

Знімок екрана (435) .png

Якщо ви намалюєте 1/ [RL] проти 1/ [L], ви отримаєте пряму лінію, нахил якої дорівнює K _d/[R _t]
Перехоплення Y буде дорівнює 1/ [R _t]. Оскільки це значення фіксоване і відоме, значення перехоплення y може служити перевіркою, щоб переконатися, що експеримент відповідає моделі

Експеримент рівноважного діалізу

Напівпроникна мембрана може бути використана в експерименті з рівноваги на основі діалізу для визначення Kd для пари ліганд-рецепторів.

Мембрана повинна бути вільно проникною, що стосується ліганду (зазвичай це невелика молекула), але представляти бар'єр для рецептора
Експеримент встановлюється з відомою концентрацією рецептора з одного боку, а відомою концентрацією ліганду - з іншого
Системі дозволено прийти до рівноваги
Експеримент вимагає проведення аналізу на ліганд

Знімок екрана (436) .png

Малюнок 6.3.1: Напівпроникний бар'єр

Після досягнення рівноваги оцінюють концентрацію ліганду по обидва боки напівпроникної мембрани:

Знімок екрана (438) .png

Малюнок 6.3.2: Концентрація рівнова

Оскільки ліганд не впливає на мембрану, концентрація ліганду на стороні без рецептора дорівнює концентрації вільного ліганду [L] скрізь у зразку (тобто по обидва боки мембрани)
Концентрація ліганду буде дорівнює концентрації вільного ліганду [L] плюс ліганд, присутній в рецепторному комплексі [RL] (іншими словами, повинна бути більша концентрація ліганду на стороні з рецептором, якщо рецептор має спорідненість до ліганду)
Концентрацію рецептор/лігандного комплексу [RL] можна визначити за різницею між цими двома значеннями
Загальна концентрація рецепторів - відома величина (експериментатор визначається на початку експерименту, і не змінюється)
Будь-яка ізотерма зв'язування може бути використана для вирішення для K _d (оскільки [R] також може бути визначено)