6.1: Генетична трансформація (з використанням бактерій та плазміди PgLo)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7424

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Генетична трансформація - це процес, за допомогою якого організм набуває і експресує новий ген. Генна інженерія - це спрямований перенесення гена, або шматочка ДНК, в клітину (як правило, бактерії). Зазвичай метою є змусити клітину експресувати (виробляти) білок, для якого кодує нещодавно введений шматок ДНК (відомий як гетерологічна експресія). Організм, який зазвичай використовується для генетичної трансформації та гетерологічної експресії людських генів/білків, - це одноклітинні бактерії, відомі як кишкова паличка (кишкова паличка). Цей організм має кілька ознак важливості в лабораторії:

Одноклітинний організм
Час подвоєння становить 20 хвилин (у мультимедійних мережах) до 1 години (мінімальна кількість носіїв)
Природно мешкає в кишечнику людини (входить до складу нормальної кишкової флори). Таким чином, нормальна температура росту становить 37° C (температура тіла людини)
Кишкова паличка має єдину хромосому, яка представляє собою кругову молекулу ДНК
Кишкова паличка грамнегативна - має внутрішню цитозольну мембрану, периплазматичний простір і зовнішню клітинну мембрану

Знімок екрана (415) .png

Малюнок 6.1.1: Геном кишкової палички

Чужорідна ДНК може бути введена в кишкову паличку як друга «хромосома», або як інша кругова молекула ДНК, яка може відтворюватися автономно через наявність власного походження реплікації. Такі «автономно відтворюються елементи» іменуються «плазмідами» або «векторами».

Знімок екрана (416) .png

Малюнок 6.1.2: Плазміда в кишковій паличці

Для того, щоб "стабільно утримувати" плазміду, потрібна якась метаболічна причина для кишкової палички, щоб тримати плазміду навколо. Якщо плазміда містить ген, який кодує білок, який захищає від антибіотиків, то лише клітини, які мають плазміду, виживуть у присутності цього антибіотика. Тому резистентність до лікарських засобів може лягти в основу "обраного маркера" для присутності плазміди у зразку кишкової палички. Ампіцилін - антибіотик для грамнегативних клітин, таких як кишкова паличка (він входить до сімейства антибіотиків пеніцилін):

Вироблення зовнішньої клітинної мембрана/структури протеоглікану пригнічується У присутності ампіциліну (летальна подія для бактерій)
Ампіцилін, як молекула, містить b -лактамну кільцеву структуру. Це кільце може бути розщеплено (а ампіцилін зруйнований) ферментом b-лактамази
фермент b-лактамази є продуктом гена bla (гени, як правило, мають нижній регістр і курсивом)
Якщо плазміда містить ген бла, вона надасть стійкість до ампіциліну господареві кишкової палички
Така кишкова паличка, вирощена в присутності ампіциліну, буде підібрана для. За цих умов будь-який дикий тип кишкової палички в зразку буде відібраний проти)
Таким чином, резистентність до ампіциліну є вибірковим маркером для плазміди

Малюнок 6.1.3: Плазміда резистентності до ампіциліну

Інші гени (які експресують інші білки) тепер можуть бути введені в плазміду, а господар кишкової палички змушений висловлювати білок, що цікавить

PgLo

Плазміди, як правило, скорочуються абревіатурою, яка починається з нижнього регістру «p», і ім'я може надати деяку інформацію щодо людини, яка спроектувала плазміду, або вміст плазміди. Плазміда PgLo містить походження або реплікацію, маркер, який можна вибрати, і ген зеленого флуоресцентного білка (GFP). Плазміда також містить ген білка арабінози С, який є білком, який регулює експресію з промотора арабінози BAD (P _BAD). Промоутери зазвичай позначаються абревіатурою, яка починається з верхнього регістру «P».

Знімок екрана (418) .png

Малюнок 6.1.4: Плазміда PgLo. Орі - це походження реплікації для плазміди pgLo, бла - ген, який кодує b-лактамазу, і є селекційним лікарсько-резистентним маркером для плазміди, GFP - ген GFP, а AraC - генне кодування білка арабінози С

«Промотор» - це область ДНК, яка сигналізує про РНК-полімеразу для ініціювання транскрипції (для виробництва мРНК). Промотори, як правило, розташовані на початку (5' кінець) гена, який кодує білок (оскільки вироблення мРНК протікає 5'->3'). Ген bla включає промотор на 5' кінці гена. Це слабкий конститутивний промоутер (завжди «включений» на низькому рівні). Він доручить РНК-полімеразі постійно робити низький рівень мРНК для цього гена. МРНК буде переведена на виробництво низького рівня білка b-лактамази. GFP транскрибується промотором арабінози P _BAD. Це сильний промотор і змусить РНК-полімеразу зробити велику кількість копій мРНК з цього гена (а отже, і багато білка GFP). Однак промотор арабінози P _BAD регулюється білком, кодованим геном AraC (який має власний промотор, подібно до гена бла):

За відсутності арабінози цукру білок AraC зв'язується з промотором PBAD і запобігає транскрипції (GFP)
У присутності арабінози в розчині білок AraC зв'язує арабінозу, і це призводить до конформаційної зміни білка AraC, результатом якої є те, що тепер він доручає РНК-полімеразі зробити багато копій МРНК GFP (і, таким чином, багато білка GFP)

Як вводиться плазміда PgLo в клітину кишкової палички?

Загальний процес, за допомогою якого чужорідна ДНК впроваджується в клітину, називається трансформацією. Існує кілька способів перетворення ДНК в клітину кишкової палички, але найпоширеніший спосіб - зробити клітини компетентними. «Грамотні» клітини мають здатність забирати молекули ДНК з навколишнього середовища. Нормальні кишкові палички не компетентні, однак, якщо їх обробляти розчином хлориду кальцію, їх клітинні мембрани стають компетентними. Власне, лише мала частка клітин, оброблених CaCl ₂, здатна займати чужорідну ДНК, однак, оскільки кількість клітин у зразку велика, низька ефективність трансформації не представляє великої проблеми. Вибрані маркери гарантують, що тільки клітини, які займають чужорідну ДНК (тобто плазміду), виживуть і ростуть.

Знімок екрана (419) .png

Малюнок 6.1.5: Перетворення кишкової палички

Вираз GFP

Додавання арабінозного цукру до середовища росту призведе до того, що РНК-полімераза почне транскрибувати ген GFP (тобто створення молекул мРНК). Клітинний механізм (наприклад, рибосоми) переведе цю мРНК у відповідний білок GFP.

GFP буде флуоресцентний зелений під ультрафіолетовим світлом
Наявність зеленого світла від клітин кишкової палички свідчить про те, що трансформація (і вибір резистентності до ліків) пройшли успішно
GFP - це ген з риби-желе і є причиною того, що деякі желе світяться зеленим кольором. Це не нормальний ген для кишкової палички, однак, якщо його вводити в кишкову паличку, він зробить білок GFP (і флуоресцентний зелений)