6.5: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7418

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Рецензія

Реплікація ДНК здійснюється ферментом ДНК-полімеразою, яка має такі характеристики:

ДНК-полімераза каталізує розширення олігонуклеотиду в напрямку 5'→3'. Він не може йти в зворотному напрямку.
Необхідний шаблон ДНК (тобто однонитковий олігонуклеотид). Це інформація, яка реплікується (через Watson-Crick бази сполучення). Якщо ви хочете повторити «чуттєву» нитку дуплексу ДНК, то шаблон - це нитка проти сенсу. Оскільки ДНК - це дуплекс, що утримується разом нековалентними силами, ми можемо відокремити нитки дуплексу (і отримати відповідний шаблон) за допомогою теплової (або лужної) денатурації.
ДНК-полімераза може лише розширити існуючий олігонуклеотид, вона не може ініціювати реплікацію. Таким чином, крім шаблону, ДНК-полімераза вимагає грунтовки олігонуклеотид. ДНК-полімераза розширює праймер у напрямку 5' → 3'.
Нуклеотиди, включені в зароджується олігонуклеотид, повинні бути нуклеозидними трифосфатами (тобто dNtP). Енергія, що виділяється при гідролізі фосфатних ангідридних зв'язків, використовується при утворенні ковалентних зв'язків (включення а-фосфату в фосфодіефірний кістяк зростаючого олігонуклеотиду)
Хоча ДНК-полімерази каталізують розширення в напрямку 5' → 3', деякі мають здатність "коректури». «Доказ читання» - це здатність розпізнавати дезінкорпорацію бази, і можливість резервного копіювання і акцизу некоректної бази, а потім продовжити далі.

Скріншот (448) .png

Малюнок 6.5.1: Синтез ДНК

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

ПЛР - це метод in vitro для ампліфікації області ДНК, яка знаходиться між двома областями відомої послідовності.
Ампліфікація ПЛР досягається за рахунок використання олігонуклеотидних праймерів. Це, як правило, короткі, однониткові олігонуклеотиди, Які доповнюють зовнішні області відомої послідовності.

Знімок екрана (449) .png

Малюнок 6.5.2: Ампліфікація ПЛР

Олігонуклеотиди служать праймерами для ДНК-полімерази, і кожна з денатурованих ниток батьківського дуплексу ДНК служить шаблоном.

Це призводить до синтезу нових ниток ДНК, які доповнюють нитки батьківського шаблону.

Етапи:

Денатурація шаблону
Відпал грунтовки
Нарощування грунтовки

складають єдиний «цикл» в методиці ампліфікації ПЛР.

Після кожного циклу новосинтезовані нитки ДНК можуть служити шаблонами в наступному циклі (праймери ПЛР зазвичай додаються зі значним молярним надлишком до ДНК шаблону)

Короткий опис продуктів в кінці кожного циклу ПЛР:

Знімок екрана (450) .png

Малюнок 6.5.3: Продукти ПЛР

Бажаний продукт ПЛР буде дуплексом фрагмента певної довжини. Виникає питання: скільки буде вироблено?

· Очікуване посилення бажаної певної довжини продукту по відношенню до вихідної концентрації шаблону «х», таким чином, може бути представлено формулою:

[(2 ⁿ - (n + 1)) - (n + 1)] х

або

(2 ^п - 2 (п + 1))

(Це часто скорочено до простого правила посилення: (2 ⁿ - 2n) х)

· Тлумачення цієї формули полягає в тому, що

Для заданої кількості циклів 'n' складаємо «2 ⁿ x» сумарні можливі дуплекси
Для заданої кількості циклів будуть дуплекси '2 (n+1) (або 2n в нашому наближенні) x', які формуються або з початкового шаблону, або фрагмента невизначеної довжини, разом з фрагментом певної довжини (і представляють небажаний добуток)
Таким чином, загальна концентрація потрібного продукту (дуплексів з довжиною, визначеною праймерами ПЛР) складе
(2 ⁿ - 2 (n+1)) x (де x - концентрація вихідного дуплексу)

Теоретичне значення посилення ніколи не досягається на практиці. Декілька факторів перешкоджають цьому виникненню, включаючи:

1. Конкуренція додаткових дочірніх ниток з праймерами для відпалу (тобто повторний відпал двох дочірніх ниток не призводить до посилення).

2. Втрата активності ферментів внаслідок термічної денатурації, особливо в пізніх циклах

3. Навіть без термічної денатурації кількість ферменту стає граничною через надлишок молярної мішені в більш пізніх циклах (тобто після 25 - 30 циклів занадто багато праймерів потребують розширення)

4. Можливий другий майданчик відпалу грунтовки і непродуктивного грунтування

Параметри теплового циклічного

Параметри термоциклічного циклу мають вирішальне значення для успішного експерименту з ПЛР. Важливі етапи кожного циклу ПЛР включають:

1. денатурація шаблону (зазвичай виконується при найвищій температурі - 100° C)

2. відпал грунтовок (температура вибирається виходячи з температури плавлення грунтовки)

3. розширення праймерів (виконується при оптимальному для використовуваної полімерази)

Репрезентативний температурний профіль для кожного циклу може виглядати наступним чином:

Знімок екрана (451) .png

Малюнок 6.5.4: Теплове циклічне

Буфери та MgCl ₂ в реакціях ПЛР

Типовий буфер реакції для ПЛР буде щось на кшталт:

Трис 10 мм, рН 8,3
50 Мм Ккл
1,5 Мм мгКл ₂
0,01% желатину
Концентрація MgCl ₂ в кінцевій реакційній суміші зазвичай становить від 0,5 до 5,0 мМ, а оптимальна концентрація визначається емпіричним шляхом (зазвичай між 1,0 - 1,5 мМ). Mg ²⁺ іони:
- утворюють розчинний комплекс з dNtP, що має важливе значення для включення dNTP
- стимулюють активність полімерази
- підвищення Tm (температури плавлення) взаємодії грунтовки/шаблону (тобто служить для стабілізації дуплексної взаємодії

Як правило,

низький Mg ²⁺ призводить до низької врожайності (або відсутності врожайності) і
високий Mg ²⁺ призводить до накопичення неспецифічних продуктів (неправильна праймінг).

Вибір полімераз для ПЛР

Одним із важливих досягнень, що дозволили розробити ПЛР, стала доступність термостабільних полімераз.
Це дозволило спочатку доданому ферменту витримати температурні цикли наближаються до 100° C.

Властивості ДНК-полімераз, що використовуються в ПЛР

	Taq/Амплітак ®	Вент™	Глибока вентиляція™	*ПФУ*	*Tth*	Ультма ™
95° C період напіврозпаду	40 хв	400 хв	1380 хв	> 120 хв	20 хв	>50 хв
Швидкість розширення (нт/сек)	75	>80	?	60	>33	?
Отримані кінці	3' A	> 95% тупий	> 95% тупий	тупий	3' A	тупий
Зміщення пасом		+	+
5 '® 3' екзо	+				+
3'® 5' екзо		+	+	+		+

Грунтовки

Дизайн грунтовки

Як правило, грунтовки використовуються 20 - 30 метрів в довжину. Це забезпечує практичні температури відпалу (високотемпературного режиму, де найбільш активна термостабільна полімераза).
Грунтовки повинні уникати розтягувань послідовностей поліоснови (наприклад, полі dG) або повторюваних мотивів - вони можуть гібридизуватися з невідповідним регістром на шаблоні.
Слід уникати перевернутих повторних послідовностей, щоб запобігти утворенню вторинної структури в грунтовці, що запобігає гібридизації шаблону
Слід уникати послідовностей, що доповнюють інші праймери, що використовуються в ПЛР, щоб запобігти гібридизації між праймерами (особливо важливо для 3-футового кінця праймера)
Якщо можливо, 3' кінець грунтовки повинен бути багатим основами G, C для посилення відпалу кінця, який буде продовжений
Відстань між праймерами має бути менше 10 Кб в довжину. Як правило, істотне зниження врожайності спостерігається, коли грунтовки відходять один від одного за межі ~3 Кб.

Температура плавлення (Tm) праймерів

Tm гібридизації грунтовки може бути розрахована за різними формулами. Найбільш часто використовувана формула:

(1) Tm = [(кількість залишків A+T) х 2° C] + [(кількість залишків G+C) x 4° C]

Приклади розрахунків T _m

	Г	A	Т	C	Т _м
15 мер	3	5	2	5	46
20 мер	6	5	4	5	62
30 мер	8	6	8	8	92

Якщо температура відпалу занадто висока, грунтовки не будуть відпалювати. Якщо він занадто низький, неправильна праймінг може відбуватися на ділянках подібної послідовності ДНК до передбачуваного місця зв'язування праймера

Аналіз ПЛР-експерименту

25-30 циклів є загальними
Основним продуктом повинна бути молекула дуплексної ДНК, кінці якої 5' і 3' визначаються двома ПЦР-праймерами.
Інші продукти, однак, можуть бути виготовлені. Вони часто представлятимуть продукти вторинних грунтувальних ділянок (неправильна грунтовка) або помилки дезінкорпорації полімерази
Таким чином, продукт ПЛР може бути неоднорідним і повинен бути відокремлений і проаналізований
Електрофорез агарозного гелю в поєднанні з фарбуванням бромідом етидію є найпоширенішим методом розділення та аналізу продуктів ПЛР