6.2: Кінетика ферментів

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 6.1: Генетична трансформація (з використанням бактерій та плазміди PgLo)
- 6.3: Зв'язування ліганду

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Ферменти є білковими каталізаторами, вони впливають на кінетику, але не на термодинаміку реакції

Збільшення швидкості хімічної реакції
Чи не змінюйте рівновагу

Скріншот (420) .png

Малюнок 6.2.1: Активність каталізатора

Вони збільшують швидкість за рахунок стабілізації перехідного стану (тобто зниження енергетичного бар'єру для формування перехідного стану) (вони не впливають на енергетику ні реагенту (реагентів), ні продукту (продуктів).

Похідне Міхаеліса-Ментена для простої стійкої кінетики

Рівняння Міхаеліса-Ментена - математична модель, яка використовується для аналізу простих кінетичних даних. Модель має певні припущення, і поки ці припущення є правильними, вона точно змоделює ваші експериментальні дані. Виведення моделі дозволить виділити ці припущення.

У реакції, що каталізується ферментом, субстрат спочатку утворює оборотний комплекс з ферментом (тобто фермент і субстрат повинні взаємодіяти, щоб фермент міг виконувати свою каталітичну функцію). Стандартний вираз, щоб показати це, є наступним:

ПРИПУЩЕННЯ #1:

На початку кінетичного аналізу продукту немає
Тому, поки ми відстежуємо початкові швидкості реакції, ми можемо ігнорувати зворотну реакцію E+P, що йде до ES

ПРИПУЩЕННЯ #2:

Під час реакції встановлено рівноважну умову зв'язування та дисоціації ферменту та субстрату (припущення Бріггса-Халдана)
Таким чином, швидкість утворення комплексу ЕС дорівнює швидкості дисоціації плюс розпад.

ПРИПУЩЕННЯ #3:

[E] << [S]
Фермент є каталізатором, він не руйнується і може бути перероблений, таким чином, потрібні лише невеликі кількості
Сума S, прив'язана до E в будь-який момент, невелика в порівнянні з кількістю вільних S
Звідси випливає, що [ES] << [S] і тому [S] є постійним під час аналізу (ПРИМІТКА: це припущення вимагає, щоб реакція контролювалася протягом короткого періоду, щоб споживалося не багато S і [S] не змінювалося ефективно - див. Наступне припущення)

ПРИПУЩЕННЯ #4:

Вимірюється тільки початкова швидкість реакції.
[P] = 0 (зворотну реакцію E + P можна ігнорувати)
[S]» [S] _{початковий}

ПРИПУЩЕННЯ #5:

Фермент присутній або у вигляді вільного ферменту, або як комплекс ES
[E] _всього = [Е] + [ES]

Похідне Міхаеліса-Ментена з використанням вищевказаних припущень:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ [E] [S] + k _-2 [E] [P]

Припущення #1 говорить, що ми можемо ігнорувати реакцію k _-2, тому:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ [E] [S]

Припущення #5 говорить [E] = [E] _{загальний} - [ES], отже:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ ([E] _{загальна} - [ES]) [S]

Швидкість розбиття ЕС являє собою поєднання дисоціації і перетворення в продукт:

Швидкість пробою ЕС = k _-1 [ES] + k ₂ [ES]

Швидкість пробою ЕС = (k _-1 + k ₂) [ES]

Припущення #2 говорить, що швидкість утворення ЕС дорівнює швидкості пробою:

k ₁ ([E] _всього - [ES]) [S] = (k _-1 + k ₂) [ES]

Перевпорядкувати для визначення з точки зору констант швидкості:

([Е] _всього - [ES]) [S]/[ES] = (k _-1 + k ₂) /k ₁

([Е] _всього [S]/[ES]) - [S] = (k _-1 + k ₂) /k ₁

Визначити нову константу, K _m = (k _-1 + k ₂)/k ₁

([Е] _всього [S]/[ES]) - [S] = K _м

Вирішіть термін [ES] (з причин, які будуть наведені на наступному кроці):

[ES] = [E] _{загальна} [S]/(K _м + [S])

Фактична швидкість реакції, виміряна в будь-який момент, задається:

V = k ₂ [ES]

Кратний обидві сторони вищевказаного рівняння на k ₂:

k ₂ [ES] = k ₂ [E] _{загальна} [S]/(K _m + [S])

таким чином

V = k ₂ [E] _{загальна} [S]/(K _м + [S])

Максимально можлива швидкість (Vmax) виникає, коли всі молекули ферменту пов'язані з субстратом [ES] = [E] _{загальна}, таким чином:

V _макс = k ₂ [E] _{загальна}

Підстановка цього в попередній вираз дає:

V = V _макс [S]/(K _м + [S])

Це математичний вираз, який використовується для моделювання експериментальних кінетичних даних

Він відомий як рівняння Міхаеліса-Ментена

Експериментальний підхід

Загальний підхід полягає в додаванні відомої концентрації субстрату до ферменту і визначенні початкової швидкості реакції для цієї концентрації субстрату.

Швидкість реакції зазвичай задається як молі (або мікромоль) продукту, виробленого за одиницю часу (сек або хв) на моль (або мікромоль) ферменту
Експеримент повторюється для широкого діапазону концентрацій субстрату
Збирається таблиця точок даних [S] проти V
Ці точки даних побудовані (V проти S) і повинні відповідати кривій, яка узгоджується з рівнянням Міхаеліса-Ментена

Терміни V _max і K _m є власними властивостями конкретної комбінації фермент/субстрат, яку ви вивчаєте

Вони будуть визначатися з особливостей сюжету V проти S.

V _макс

Існує обмежена кількість молекул ферменту, і вони можуть виконувати лише одну реакцію за один раз. Таким чином, при високих [S] ферменти можуть бути насичені

В умовах насичення реакція йде так швидко, як може, а додаткові збільшення [S] не збільшують швидкість реакції.
Максимальна спостережувана швидкість дорівнює V _max, і дані будуть асимптотично до цього значення при високому [S]
При низькому [S] швидкість реакції, як правило, лінійно пропорційна [S] (тобто при низькому [S] якщо ви подвоїте [S], V подвоїться)

К _м

K _m = (k _-1 + k ₂)/k ₁ = (швидкість пробою ЕС)/(швидкість утворення ЕС)

K _m схожа, але не зовсім дорівнює, константа дисоціації (K _d) для комплексу ЕС
Якщо k _-1 >> k ₂, то K _m» K _d
Завдяки такій схожості з виразом для K _d, низьке значення K _m часто інтерпретується як висока спорідненість ферменту до субстрату, а велике значення для K _m часто інтерпретується як слабка спорідненість ферменту до субстрату.
K _m має одиниці молярної концентрації (так само, як і одиниці для [S])

Існує математична обробка, яка дозволяє визначити Км за експериментальними V проти [S] даних

Розглянемо ситуацію, коли оцінюється [S] призводить до значення V, що дорівнює рівно ^_1/2 максимальної швидкості реакції:

V = V _макс [S]/(K _м + [S])

^_1/2 В _макс = V _макс [S]/(K _м + [S])

^_1/2 = [С]/(К _м + [С])

К _м + [S] = 2 [S]

К _м = [S]

Таким чином, K _m дорівнює концентрації субстрату, що призводить рівно до половини максимально можливої швидкості реакції.

Знімок екрана (421) .png

Малюнок 6.2.2: К _м

Лінвівер-Берк («подвійний взаємний» сюжет)

Рівняння Міхаеліса-Ментена можна переставити, взявши взаємні, щоб отримати:

Знімок екрана (422) .png

Якщо X = 1/ [S] і Y=1/V, то це лінійне рівняння з _{нахилом} K м/V _max і перехопленням Y 1/ V _max

Знімок екрана (423) .png

Малюнок 6.2.3: 1/S і1/V

Так як графік даних 1/ [S] проти 1/v повинен бути прямою лінією, то простіше пристосувати лінійну функцію до даних у такому вигляді, а Vmax і K _m можна легко визначити за графіком

оборотне гальмування

Існує дві основні категорії оборотних інгібіторів: конкурентні оборотні інгібітори та неконкурентні оборотні інгібітори:

конкурентні інгібітори

Інгібітор (I) конкурує з субстратом (S) за активну ділянку ферменту (також відомий як сайт S-зв'язування). Зв'язування будь-якої з цих молекул в активній ділянці є взаємовиключним подією.

Субстрат і інгібітор мають високий ступінь структурної схожості. Однак інгібітор не може протікати через реакцію на отримання продукту.
Збільшення концентрації субстрату перевершить інгібітор по зв'язуванню з активною ділянкою ферменту.
Конкурентний оборотний інгібітор може бути ідентифікований за його характерним впливом на кінетичні дані

Вираз для експресії Міхаеліса-Ментена в присутності оборотного конкурентного інгібітора є:

V = V _макс [S]/(K _м (1+ [I] /K _i) + [S])

Де K _i - фактична константа дисоціації комплексу EI

Вплив оборотного конкурентного інгібітора на кінетику полягає в наступному:

Якщо немає інгібітора (тобто якщо [I] = 0), то рівняння однакові
Як інгібітор додається, ефект полягає в зміні видимого значення K _m. Зокрема, видимий K _m буде збільшений на величину, рівну (1 + [I] /K _I). Якщо K _m збільшити, швидкість реакції v зменшиться.
Зауважте, що коли [S] стає дуже великим, значення знаменника по суті дорівнює [S] і v @ v _max. Таким чином, швидкість реакції може бути приведена до vmax з досить високою концентрацією субстрату

Діагностичними критеріями оборотного конкурентного інгібування є те, що, хоча на очевидний Км впливає додавання інгібітора, значення v _max не змінюється

Знімок екрана (424) .png

Малюнок 6.2.4: Вплив оборотного конкурентного інгібітора

Як впливає подвійний зворотний сюжет Лайнвівер-Берка від наявності оборотного конкурентного інгібітора?

Знімок екрана (425) .png

Малюнок 6.2.5: Подвійний зворотний графік з оборотним конкурентним інгібітором

неконкурентні інгібітори

Неконкурентні інгібітори реагують як з Е, так і з ЕС (це пов'язано з тим, що неконкурентний інгібітор не зв'язується на тому ж місці в ферменті, що і субстрат)

Інгібування неможливо подолати шляхом збільшення концентрації S
Вплив на кінетику полягає в тому, ніби фермент був менш активним (v _max знижується), але що спорідненість до субстрату не впливає (K _m залишається незмінним), оскільки місце зв'язування субстрату не зайнято неконкурентним інгібітором.

Знімок екрана (426) .png

Малюнок 6.2.6: Вплив оборотного неконкурентного інгібітора

Малюнок 6.2.7: Подвійний зворотний сюжет з неконкурентним інгібітором