6.2: Кінетика ферментів

Ферменти є білковими каталізаторами, вони впливають на кінетику, але не на термодинаміку реакції

• Збільшення швидкості хімічної реакції
• Чи не змінюйте рівновагу

Малюнок 6.2.1: Активність каталізатора

• Вони збільшують швидкість за рахунок стабілізації перехідного стану (тобто зниження енергетичного бар'єру для формування перехідного стану) (вони не впливають на енергетику ні реагенту (реагентів), ні продукту (продуктів).

Похідне Міхаеліса-Ментена для простої стійкої кінетики

Рівняння Міхаеліса-Ментена - математична модель, яка використовується для аналізу простих кінетичних даних. Модель має певні припущення, і поки ці припущення є правильними, вона точно змоделює ваші експериментальні дані. Виведення моделі дозволить виділити ці припущення.

У реакції, що каталізується ферментом, субстрат спочатку утворює оборотний комплекс з ферментом (тобто фермент і субстрат повинні взаємодіяти, щоб фермент міг виконувати свою каталітичну функцію). Стандартний вираз, щоб показати це, є наступним:

ПРИПУЩЕННЯ #1:

• На початку кінетичного аналізу продукту немає
• Тому, поки ми відстежуємо початкові швидкості реакції, ми можемо ігнорувати зворотну реакцію E+P, що йде до ES

ПРИПУЩЕННЯ #2:

• Під час реакції встановлено рівноважну умову зв'язування та дисоціації ферменту та субстрату (припущення Бріггса-Халдана)
• Таким чином, швидкість утворення комплексу ЕС дорівнює швидкості дисоціації плюс розпад.

ПРИПУЩЕННЯ #3:

• [E] << [S]
• Фермент є каталізатором, він не руйнується і може бути перероблений, таким чином, потрібні лише невеликі кількості
• Сума S, прив'язана до E в будь-який момент, невелика в порівнянні з кількістю вільних S
• Звідси випливає, що [ES] << [S] і тому [S] є постійним під час аналізу (ПРИМІТКА: це припущення вимагає, щоб реакція контролювалася протягом короткого періоду, щоб споживалося не багато S і [S] не змінювалося ефективно - див. Наступне припущення)

ПРИПУЩЕННЯ #4:

• Вимірюється тільки початкова швидкість реакції.
• [P] = 0 (зворотну реакцію E + P можна ігнорувати)
• [S]» [S] _{початковий}

ПРИПУЩЕННЯ #5:

• Фермент присутній або у вигляді вільного ферменту, або як комплекс ES
• [E] _всього = [Е] + [ES]

---

Похідне Міхаеліса-Ментена з використанням вищевказаних припущень:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ [E] [S] + k _-2 [E] [P]

Припущення #1 говорить, що ми можемо ігнорувати реакцію k _-2, тому:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ [E] [S]

Припущення #5 говорить [E] = [E] _{загальний} - [ES], отже:

Швидкість утворення ЕС = k ₁ ([E] _{загальна} - [ES]) [S]

Швидкість розбиття ЕС являє собою поєднання дисоціації і перетворення в продукт:

Швидкість пробою ЕС = k _-1 [ES] + k ₂ [ES]

Швидкість пробою ЕС = (k _-1 + k ₂) [ES]

Припущення #2 говорить, що швидкість утворення ЕС дорівнює швидкості пробою:

k ₁ ([E] _всього - [ES]) [S] = (k _-1 + k ₂) [ES]

Перевпорядкувати для визначення з точки зору констант швидкості:

([Е] _всього - [ES]) [S]/[ES] = (k _-1 + k ₂) /k ₁

([Е] _всього [S]/[ES]) - [S] = (k _-1 + k ₂) /k ₁

Визначити нову константу, K _m = (k _-1 + k ₂)/k ₁

([Е] _всього [S]/[ES]) - [S] = K _м

Вирішіть термін [ES] (з причин, які будуть наведені на наступному кроці):

[ES] = [E] _{загальна} [S]/(K _м + [S])

Фактична швидкість реакції, виміряна в будь-який момент, задається:

V = k ₂ [ES]

Кратний обидві сторони вищевказаного рівняння на k ₂:

k ₂ [ES] = k ₂ [E] _{загальна} [S]/(K _m + [S])

таким чином

V = k ₂ [E] _{загальна} [S]/(K _м + [S])

Максимально можлива швидкість (Vmax) виникає, коли всі молекули ферменту пов'язані з субстратом [ES] = [E] _{загальна}, таким чином:

V _макс = k ₂ [E] _{загальна}

Підстановка цього в попередній вираз дає:

V = V _макс [S]/(K _м + [S])

Це математичний вираз, який використовується для моделювання експериментальних кінетичних даних

Він відомий як рівняння Міхаеліса-Ментена

---

Експериментальний підхід

Загальний підхід полягає в додаванні відомої концентрації субстрату до ферменту і визначенні початкової швидкості реакції для цієї концентрації субстрату.

• Швидкість реакції зазвичай задається як молі (або мікромоль) продукту, виробленого за одиницю часу (сек або хв) на моль (або мікромоль) ферменту
• Експеримент повторюється для широкого діапазону концентрацій субстрату
• Збирається таблиця точок даних [S] проти V
• Ці точки даних побудовані (V проти S) і повинні відповідати кривій, яка узгоджується з рівнянням Міхаеліса-Ментена

Терміни V _max і K _m є власними властивостями конкретної комбінації фермент/субстрат, яку ви вивчаєте

• Вони будуть визначатися з особливостей сюжету V проти S.

V _макс

Існує обмежена кількість молекул ферменту, і вони можуть виконувати лише одну реакцію за один раз. Таким чином, при високих [S] ферменти можуть бути насичені

• В умовах насичення реакція йде так швидко, як може, а додаткові збільшення [S] не збільшують швидкість реакції.
• Максимальна спостережувана швидкість дорівнює V _max, і дані будуть асимптотично до цього значення при високому [S]
• При низькому [S] швидкість реакції, як правило, лінійно пропорційна [S] (тобто при низькому [S] якщо ви подвоїте [S], V подвоїться)

К _м

K _m = (k _-1 + k ₂)/k ₁ = (швидкість пробою ЕС)/(швидкість утворення ЕС)

• K _m схожа, але не зовсім дорівнює, константа дисоціації (K _d) для комплексу ЕС
• Якщо k _-1 >> k ₂, то K _m» K _d
• Завдяки такій схожості з виразом для K _d, низьке значення K _m часто інтерпретується як висока спорідненість ферменту до субстрату, а велике значення для K _m часто інтерпретується як слабка спорідненість ферменту до субстрату.
• K _m має одиниці молярної концентрації (так само, як і одиниці для [S])

Існує математична обробка, яка дозволяє визначити Км за експериментальними V проти [S] даних

• Розглянемо ситуацію, коли оцінюється [S] призводить до значення V, що дорівнює рівно ^_1/2 максимальної швидкості реакції:

V = V _макс [S]/(K _м + [S])

^_1/2 В _макс = V _макс [S]/(K _м + [S])

^_1/2 = [С]/(К _м + [С])

К _м + [S] = 2 [S]

К _м = [S]

Таким чином, K _m дорівнює концентрації субстрату, що призводить рівно до половини максимально можливої швидкості реакції.

Малюнок 6.2.2: К _м

Лінвівер-Берк («подвійний взаємний» сюжет)

• Рівняння Міхаеліса-Ментена можна переставити, взявши взаємні, щоб отримати:

• Якщо X = 1/ [S] і Y=1/V, то це лінійне рівняння з _{нахилом} K м/V _max і перехопленням Y 1/ V _max

Малюнок 6.2.3: 1/S і1/V

• Так як графік даних 1/ [S] проти 1/v повинен бути прямою лінією, то простіше пристосувати лінійну функцію до даних у такому вигляді, а Vmax і K _m можна легко визначити за графіком

оборотне гальмування

Існує дві основні категорії оборотних інгібіторів: конкурентні оборотні інгібітори та неконкурентні оборотні інгібітори:

конкурентні інгібітори

Інгібітор (I) конкурує з субстратом (S) за активну ділянку ферменту (також відомий як сайт S-зв'язування). Зв'язування будь-якої з цих молекул в активній ділянці є взаємовиключним подією.

• Субстрат і інгібітор мають високий ступінь структурної схожості. Однак інгібітор не може протікати через реакцію на отримання продукту.
• Збільшення концентрації субстрату перевершить інгібітор по зв'язуванню з активною ділянкою ферменту.
• Конкурентний оборотний інгібітор може бути ідентифікований за його характерним впливом на кінетичні дані

Вираз для експресії Міхаеліса-Ментена в присутності оборотного конкурентного інгібітора є:

V = V _макс [S]/(K _м (1+ [I] /K _i) + [S])

Де K _i - фактична константа дисоціації комплексу EI

Вплив оборотного конкурентного інгібітора на кінетику полягає в наступному:

• Якщо немає інгібітора (тобто якщо [I] = 0), то рівняння однакові
• Як інгібітор додається, ефект полягає в зміні видимого значення K _m. Зокрема, видимий K _m буде збільшений на величину, рівну (1 + [I] /K _I). Якщо K _m збільшити, швидкість реакції v зменшиться.
• Зауважте, що коли [S] стає дуже великим, значення знаменника по суті дорівнює [S] і v @ v _max. Таким чином, швидкість реакції може бути приведена до vmax з досить високою концентрацією субстрату

Діагностичними критеріями оборотного конкурентного інгібування є те, що, хоча на очевидний Км впливає додавання інгібітора, значення v _max не змінюється

Малюнок 6.2.4: Вплив оборотного конкурентного інгібітора

Як впливає подвійний зворотний сюжет Лайнвівер-Берка від наявності оборотного конкурентного інгібітора?

Малюнок 6.2.5: Подвійний зворотний графік з оборотним конкурентним інгібітором

неконкурентні інгібітори

Неконкурентні інгібітори реагують як з Е, так і з ЕС (це пов'язано з тим, що неконкурентний інгібітор не зв'язується на тому ж місці в ферменті, що і субстрат)

• Інгібування неможливо подолати шляхом збільшення концентрації S
• Вплив на кінетику полягає в тому, ніби фермент був менш активним (v _max знижується), але що спорідненість до субстрату не впливає (K _m залишається незмінним), оскільки місце зв'язування субстрату не зайнято неконкурентним інгібітором.

Малюнок 6.2.6: Вплив оборотного неконкурентного інгібітора

Малюнок 6.2.7: Подвійний зворотний сюжет з неконкурентним інгібітором