14.6: Виникнення стійкості до наркотиків

Цілі навчання

• Опишіть, як дифузійний тест Кірбі-Бауера визначає сприйнятливість мікроба до антибактеріального препарату.
• Поясніть значення мінімальної інгібуючої концентрації і мінімальної бактерицидної концентрації щодо ефективності антимікробного препарату.

Перевірка ефективності протимікробних препаратів проти конкретних організмів має важливе значення при виявленні їх спектру активності та терапевтичної дозування. Цей тип тесту, який зазвичай описується як тестування на чутливість до антимікробних препаратів (АСТ), зазвичай проводиться в клінічній лабораторії. У цьому розділі ми обговоримо поширені методи перевірки ефективності протимікробних препаратів.

Тест на дифузію диска Кірбі-Бауера

Дисковий дифузійний тест Кірбі-Бауера давно використовується як відправна точка для визначення сприйнятливості специфічних мікробів до різних протимікробних препаратів. Аналіз Кірбі-Бауера починається з агарної пластини Мюлера-Хінтона, на якій злитий газон прищеплюється ізольованим бактеріальним збудником пацієнта. Диски фільтрувального паперу, просочені відомими кількостями антибактеріальних препаратів, що підлягають випробуванню, потім поміщають на агарну пластину. У міру зростання бактеріального інокуляту антибіотик дифундує з кругового диска в агар і взаємодіє з зростаючими бактеріями. Антибактеріальна активність спостерігається у вигляді чіткої кругової зони інгібування навколо просоченого препаратом диска, подібного до диско-дифузійного аналізу. Діаметр зони інгібування, вимірюваний в міліметрах і в порівнянні зі стандартизованою діаграмою, визначає сприйнятливість або резистентність бактеріального збудника до препарату.

Існує безліч факторів, які визначають розмір зони інгібування в цьому аналізі, включаючи розчинність лікарського засобу, швидкість дифузії лікарського засобу через агар, товщину агарного середовища та концентрацію препарату, просоченого в диск. Через відсутність стандартизації цих факторів інтерпретація аналізу дифузії диска Кірбі-Бауера надає лише обмежену інформацію про сприйнятливість та резистентність до випробуваних препаратів. Аналіз не може розрізняти бактеріостатичну та бактерицидну активність, а відмінності в розмірах зон не можуть бути використані для порівняння потенцій або ефективності ліків. Порівняння розмірів зон зі стандартизованою таблицею дасть лише інформацію про антибактеріальні засоби, до яких бактеріальний збудник сприйнятливий або стійкий.

Вправа\(\PageIndex{1}\)

Як використовувати інформацію з аналізу Кірбі-Бауера для прогнозування терапевтичної ефективності антимікробного препарату у пацієнта?

Антибіограми: Беручи деякі здогадки з рецептів

На жаль, інфекційні захворювання не займають тайм-ауту для лабораторних робіт. Як результат, лікарі рідко мають розкіш проведення тестування на сприйнятливість до того, як вони випишуть рецепт. Натомість вони покладаються насамперед на емпіричні докази (тобто ознаки та симптоми захворювання) та свій професійний досвід, щоб зробити освічене здогадання щодо діагнозу, збудника (збудників) та наркотиків, які, швидше за все, будуть ефективними. Такий підхід дозволяє почати лікування раніше, тому пацієнту не доведеться чекати результатів лабораторних аналізів. У багатьох випадках рецепт ефективний, однак у віці підвищеної стійкості до протимікробних препаратів стає все складніше підібрати найбільш підходящу емпіричну терапію. Вибір невідповідної емпіричної терапії не тільки ставить пацієнта під загрозу, але може сприяти більшій стійкості до призначеного препарату.

Останнім часом дослідження показали, що антибіотики є корисними інструментами в процесі прийняття рішень щодо вибору відповідної емпіричної терапії. Антибіограма - це компіляція даних місцевої чутливості до антибіотиків, розбитих за бактеріальним збудником. У дослідженні листопада 2014 року, опублікованому в журналі Infection Control and Hospital Epidemiology, дослідники визначили, що 85% рецептів, замовлених у кваліфікованих медичних установах, були вирішені емпірично, але лише 35% цих рецептів були визнані доречними у порівнянні з можлива ідентифікація збудника та профіль сприйнятливості, отримані в клінічній лабораторії. Однак в одному сестринському закладі, де застосовувалося застосування антибіотиків для безпосереднього підбору емпіричної терапії, доцільність емпіричної терапії зросла з 32% до впровадження антибіотикограми до 45% після впровадження антибіограм. ¹ Хоча ці дані є попередніми, вони припускають, що медичні заклади можуть зменшити кількість невідповідних рецептів, використовуючи антибіограми для вибору емпіричної терапії, тим самим приносячи користь пацієнтам та мінімізуючи можливості розвитку стійкості до протимікробних препаратів.

Тести на розведення

Як обговорювалося, обмеження дискового дифузійного тесту Кірбі-Бауера не дозволяють проводити пряме порівняння антибактеріальних потенцій для керівництва вибором найкращого терапевтичного вибору. Однак антибактеріальні тести на розведення можуть бути використані для визначення мінімальної інгібуючої концентрації конкретного препарату (МІК), найнижчої концентрації препарату, що пригнічує видимий ріст бактерій, та мінімальної бактерицидної концентрації (MBC), найнижчої концентрації препарату, яка вбиває ≥ 99,9% початкового інокуляту . Визначення цих концентрацій допомагає виявити правильний препарат для конкретного збудника. Для аналізу на розведення макробульйону в пробірках роблять ряд розведення препарату у відварі і в кожну пробірку додають таку ж кількість клітин досліджуваного штаму бактерій (рис.\(\PageIndex{1}\)). МІК визначається шляхом дослідження пробок, щоб знайти найнижчу концентрацію препарату, яка пригнічує видимий ріст; це спостерігається як помутніння (помутніння) у бульйоні. Потім пробірки без видимого росту прищеплюють на агарові середовища без антибіотика для визначення МБК. Як правило, рівень антибактеріального препарату в сироватці крові повинен бути принаймні в три-п'ять разів вище MIC для лікування інфекції.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): У тесті на розведення найнижчим розведенням, що пригнічує помутніння (помутніння), є MIC. У цьому прикладі мікрофон становить 8 мкг/мл. Відвар із зразків без каламутності можна щепити на пластини, в яких відсутні антимікробний препарат. Найнижче розведення, яке вбиває ≥ 99,9% початкового інокуляту, спостерігається на пластин, - це МБК. (Кредит: модифікація роботи Сюзанни Вакім)

Аналіз MIC також може бути виконаний за допомогою 96-луночних лотків для мікророзведення, які дозволяють використовувати невеликі обсяги і автоматизовані дозуючі пристрої, а також тестування декількох протимікробних препаратів і/або мікроорганізмів в одному лотку (рис.\(\PageIndex{2}\)). МІС інтерпретуються як найнижча концентрація, яка пригнічує видимий ріст, так само, як і для розведення макробульйону в пробірках. Зростання також можна інтерпретувати візуально або за допомогою спектрофотометра або подібного пристрою для виявлення каламутності або зміни кольору, якщо відповідний біохімічний субстрат, який змінює колір при наявності росту бактерій, також включений в кожну лунку.

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Лоток для мікророзведення також може бути використаний для визначення мікросхем декількох антимікробних препаратів в одному аналізі. У цьому прикладі концентрації препарату збільшуються зліва направо, а ліворуч від пластини вказані ряди з кліндаміцином, пеніциліном та еритроміцином. Для пеніциліну та еритроміцину найнижчі концентрації, які гальмували видимий ріст, позначаються червоними колами і становили 0,06 мкг/мл для пеніциліну і 8 мкг/мл для еритроміцину. Для кліндаміцину спостерігався видимий ріст бактерій при кожній концентрації до 32 мкг/мл, а МІК інтерпретується як >32 мкг/мл. (кредит: зміна роботи Центрів контролю та профілактики захворювань)

Етест - це альтернативний метод, який використовується для визначення MIC, і являє собою комбінацію методів дифузійного тесту та розведення дисків Кірбі-Бауера. Подібно до аналізу Кірбі-Бауера, злитий газон бактеріального ізоляту прищеплюється на поверхню агарової пластини. Замість того, щоб використовувати кругові диски, просочені однією концентрацією препарату, однак, на поверхню інокульованої агарової пластини розміщують комерційно доступні пластикові смужки, які містять градієнт антибактеріального засобу (рис.\(\PageIndex{3}\)). У міру зростання бактеріального інокуляту антибіотик дифундує з пластикових смужок в агар і взаємодіє з бактеріальними клітинами. Оскільки швидкість дифузії препарату безпосередньо пов'язана з концентрацією, еліптична зона інгібування спостерігається з градієнтом препарату Етест, а не кругова зона інгібування, що спостерігається при аналізі Кірбі-Бауера. Для інтерпретації результатів перетин еліптичної зони з градієнтом на медикаментозної смужці вказує на МІК. Оскільки кілька смужок, що містять різні протимікробні препарати, можуть бути розміщені на одній пластині, MIC декількох протимікробних препаратів можна визначити одночасно та безпосередньо порівнювати. Однак, на відміну від методів розведення макробульйону та мікробульйону, MBC не можна визначити за допомогою Etest.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Етест може бути використаний для визначення МІК антибіотика. У цьому Етесті показано, що ванкоміцин має МІК 1,5 мкг/мл проти золотистого стафілокока.

Вправа\(\PageIndex{2}\)

Порівняйте і контрастуйте MIC і MBC.

Клінічна спрямованість: Дозвіл

UTI Маріси, ймовірно, був викликаний катетеризаціями, які вона мала у В'єтнамі. Більшість бактерій, що викликають ІМП, є членами нормальної мікробіоти кишечника, але вони можуть викликати інфекції при введенні в сечовивідні шляхи, як це могло статися при введенні катетера. Як варіант, якби сам катетер не був стерильним, бактерії на його поверхні могли бути введені в організм Маріси. Антимікробна терапія Маріса, отримана в Камбоджі, також може бути ускладнюючим фактором, оскільки вона, можливо, вибрала для антимікробно-резистентних штамів, які вже присутні в її організмі. Ці бактерії вже містили б гени протимікробної стійкості, або придбані спонтанною мутацією, або через горизонтальний перенесення генів, і, отже, мали найкращу еволюційну перевагу для адаптації та росту при наявності антимікробної терапії. В результаті один з цих резистентних штамів, можливо, згодом був введений в її сечовивідні шляхи.

Лабораторні дослідження в CDC підтвердили, що штам Klebsiella pneumoniae із зразка сечі Маріси був позитивним на наявність NDM, дуже активної карбапенемази, яка починає виникати як нова проблема резистентності до протимікробних препаратів. Хоча NDM-позитивні штами стійкі до широкого спектру протимікробних препаратів, вони показали сприйнятливість до тигецикліну (структурно пов'язаного з тетрацикліном) та поліміксинів В і Е (колістин).

Щоб запобігти поширенню інфекції, Марісу ізолювали від інших пацієнтів в окремій кімнаті. Всім співробітникам лікарні, які взаємодіють з нею, було рекомендовано дотримуватися суворих протоколів, щоб запобігти забрудненню поверхні та обладнання. Це буде включати особливо суворі практики гігієни рук і ретельну дезінфекцію всіх предметів, що контактують з нею.

Інфекція Маріси нарешті відреагувала на тигециклін і врешті-решт очистилася. Її виписали через кілька тижнів після прийому, і наступний зразок стільця показав, що її стілець не містить NDM, що містить K. pneumoniae, що означає, що вона більше не вкривала високостійку бактерію.

Ключові поняття та резюме

• Тест на дифузію диска Кірбі-Бауера допомагає визначити сприйнятливість мікроорганізму до різних протимікробних препаратів. Однак вимірювані зони інгібування повинні співвідноситися з відомими стандартами для визначення сприйнятливості та резистентності, а також не надавати інформацію про бактерицидну та бактеріостатичну активність або дозволяти безпосередньо порівнювати потенції ліків.
• Антибіограми корисні для моніторингу місцевих тенденцій резистентності/сприйнятливості до протимікробних препаратів та для спрямування відповідного вибору емпіричної антибактеріальної терапії.
• Існує кілька лабораторних методів визначення мінімальної інгібіторної концентрації (МІК) антимікробного препарату проти конкретного мікроба. Мінімальну бактерицидну концентрацію (MBC) також можна визначити, як правило, як наступний експеримент з визначення MIC за допомогою методу розведення трубки.

Виноски

1. 1 J.P Фуруно та ін. «Використання антибіотиків для поліпшення призначення антибіотиків у кваліфікованих медичних установах». Інфекційний контроль та лікарняна епідеміологія 35 немає. Постачання S3 (2014) :S56-61.