20.2: Клонування

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7847

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Взагалі, клонування означає створення ідеальної репліки. Як правило, слово використовується для опису створення генетично ідентичної копії. У біології відродження цілого організму називають «репродуктивним клонуванням». Задовго до того, як були зроблені спроби клонувати цілий організм, дослідники навчилися копіювати короткі ділянки ДНК - процес, який називають молекулярним клонуванням.

Молекулярне клонування

Клонування дозволяє створювати множинні копії генів, експресію генів та вивчати конкретні гени. Щоб отримати фрагмент ДНК в бактеріальну клітину в формі, яка буде скопійована або виражена, фрагмент спочатку вставляється в плазміду. Плазміда (в цьому контексті також називається вектором) - це невелика кругова молекула ДНК, яка реплікується незалежно від хромосомної ДНК у бактерій. При клонуванні молекули плазміди можуть бути використані для забезпечення «транспортного засобу», в який можна вставити потрібний фрагмент ДНК. Модифіковані плазміди зазвичай повторно вводяться в бактеріальний господар для реплікації. У міру поділу бактерій вони копіюють власну ДНК (включаючи плазміди). Вставлений фрагмент ДНК копіюється разом з рештою бактеріальної ДНК. У бактеріальній клітині фрагмент ДНК з генома людини (або іншого досліджуваного організму) називають чужорідною ДНК, щоб диференціювати його від ДНК бактерії (ДНК господаря).

На цьому зображенні показано малюнок лінії бактерії з її хромосомною ДНК і декількома плазмідами всередині неї. Бактерія малюється у вигляді великого овалу. Усередині бактерії кола малого та середнього розміру ілюструють плазміди, а одна довга тонка замкнута лінія, яка перетинається, неодноразово ілюструє хромосомну ДНК. — **Малюнок\(\PageIndex{1}\):** Плазміди зустрічаються природним чином у бактеріях, але також можуть бути змінені вченими. (CC BY-SA 2.5; Спауллі через Вікісховище)

Плазміди зустрічаються природним шляхом у бактеріальних популяціях (таких як кишкова паличка) і мають гени, які можуть сприяти сприятливим рисам організму, таким як резистентність до антибіотиків (здатність не впливати на антибіотики). Плазміди були високо розроблені як вектори для молекулярного клонування та подальшого масштабного виробництва важливих молекул, таких як інсулін. Цінною характеристикою плазмідних векторів є легкість, з якою може бути введений чужорідний фрагмент ДНК. Ці плазмідні вектори містять багато коротких послідовностей ДНК, які можна розрізати різними загальнодоступними рестрикторними ферментами. Рестрикційні ферменти (також звані рестрикторними ендонуклеазами) розпізнають конкретні послідовності ДНК і розрізають їх передбачуваним чином; вони природним чином виробляються бактеріями як захисний механізм проти чужорідної ДНК. Багато рестрикційних ферментів роблять шахові надрізи в двох нитках ДНК, так що зрізані кінці мають від 2 до 4-нуклеотидний однонитковий звис. Послідовність, яка розпізнається рестрикційним ферментом, - це послідовність від чотирьох до восьми нуклеотидів, яка є паліндромом. Як і при слові паліндром, це означає, що послідовність читається однаково вперед і назад. У більшості випадків послідовність читається однаково вперед на одну пасмо і назад на доповнює пасмо. Коли робиться розріз в шаховому порядку в такій послідовності, звиси доповнюють (рис.\(\PageIndex{2}\)).

У частині А на малюнку зображена нитка сходоподібної ДНК. У частині B ДНК розрізається на обох нитках між двома гуанінами. У частині С 2 нитки відокремилися, залишаючи додаткові липкі кінці на кожному з неприкріпленими нуклеотидами 5' до 3' G, A, T і C. — **Малюнок\(\PageIndex{2}\):** У цьому (a) місці розпізнавання ферментів із шестинуклеотидним рестрикцією зверніть увагу, що послідовність шести нуклеотидів читає те ж саме в напрямку 5 ′ до 3 ′ на одній нитці, як це робиться в напрямку від 5 до 3 ′ на додатковій нитку. Це відоме як паліндром. (б) Рестрикційний фермент робить розриви в нитках ДНК, і (c) розріз в ДНК призводить до «липких кінців». Інший шматок ДНК, вирізаний з обох кінців тим же рестрикційним ферментом, може прикріпитися до цих липких кінців і бути вставлений у щілину, зроблену цим розрізом.

Оскільки ці звіси здатні повернутися разом за допомогою водневого зв'язку з додатковими нависами на шматочку ДНК, вирізаного з тим же рестрикційним ферментом, вони називаються «липкими кінцями». Процес формування водневих зв'язків між комплементарними послідовностями на окремих нитках з утворенням дволанцюгової ДНК називається відпалом. Додавання ферменту під назвою ДНК-лігаза, який бере участь у реплікації ДНК в клітині, постійно приєднується до фрагментів ДНК, коли липкі кінці збираються разом. Таким чином, будь-який фрагмент ДНК може бути зрощений між двома кінцями плазмідної ДНК, яка була розрізана тим же рестрикційним ферментом (рис.\(\PageIndex{3}\)).

Малюнок ілюструє кроки молекулярного клонування в плазміду, яка називається клонуючим вектором. Вектор має ген LacZ, який необхідний для метаболізації лактози, і ген стійкості до ампіциліну. У гені LaCZ знаходяться місця рестрикції, послідовності ДНК, розрізані певним рестрикційним ферментом. ДНК, що підлягає клонуванню, і плазміда вирізаються одним і тим же рестрикційним ферментом. Фермент рестрикції хитить розрізи на двох нитках ДНК, таким чином, що кожна нитка має нависає однонитковий біт ДНК. На одній пасмі послідовність начісування - GATC, а на іншій послідовність - CTAG. Ці дві послідовності є взаємодоповнюючими і дозволяють фрагменту чужорідної ДНК відпалювати плазмідою. Фермент під назвою лігаза з'єднує дві частини разом. Потім лігована плазміда перетворюється в бактеріальний штам, якому не вистачає гена LacZ і чутливий до антибіотика ампіциліну. Бактерії наносяться на середовища, що містять ампіцилін, так що будуть рости лише бактерії, які взяли плазміду (яка має ген стійкості до ампіциліну). Засоби масової інформації також містять X-gal, хімічну речовину, яка метаболізується так само, як лактоза. Плазміди, які не мають вставки, здатні метаболізувати X-gal, вивільняючи барвник з X-gal, який перетворює колонію в синій колір. Плазміди з вставкою мають порушений ген LaCZ і продукують білі колонії. Таким чином, колонії, що містять клоновану ДНК, можна підбирати виходячи з кольору. — **Малюнок\(\PageIndex{3}\):** Ця діаграма показує кроки, що беруть участь у молекулярному клонуванні.

Плазміди з вставленими в них чужорідними ДНК називаються рекомбінантними молекулами ДНК, оскільки вони містять нові комбінації генетичного матеріалу. Білки, які виробляються з рекомбінантних молекул ДНК, називаються рекомбінантними білками. Не всі рекомбінантні плазміди здатні експресувати гени. Плазміди також можуть бути розроблені для експресії білків лише при стимулюванні певними факторами навколишнього середовища, щоб вчені могли контролювати експресію рекомбінантних білків.

Клітинне клонування

Одноклітинні організми, такі як бактерії та дріжджі, природним чином виробляють клони себе, коли вони розмножуються безстатевим шляхом бінарного поділу; це відомо як клітинне клонування. Ядерна ДНК дублюється процесом мітозу, що створює точну копію генетичного матеріалу.

репродуктивне клонування

Репродуктивне клонування - це метод, який використовується для створення клону або ідентичної копії всього багатоклітинного організму. Більшість багатоклітинних організмів піддаються розмноженню статевим шляхом, що передбачає внесок ДНК двох особин (батьків), що робить неможливим генерування ідентичної копії або клону будь-якого з батьків. Останні досягнення в біотехнології дозволили репродуктивно клонувати ссавців в лабораторії.

Природне статеве розмноження передбачає об'єднання, під час запліднення, сперматозоїда і яйцеклітини. Кожна з цих гамет є гаплоїдними, тобто вони містять один набір хромосом у своїх ядрах. Отримана клітина, або зигота, потім диплоїдна і містить два набори хромосом. Ця клітина ділиться мітотично, щоб виробляти багатоклітинний організм. Однак об'єднання будь-яких двох клітин не може виробляти життєздатну зиготу; в цитоплазмі яйцеклітини є компоненти, які необхідні для раннього розвитку ембріона під час його перших кількох клітинних поділів. Без цих положень не було б подальшого розвитку. Тому для вироблення нової особини потрібно як диплоїдний генетичний комплемент, так і цитоплазма яйцеклітини. Підхід до виробництва штучно клонованої особини полягає у взятті яйцеклітини однієї особини і видаленні гаплоїдного ядра (рис.\(\PageIndex{4}\)). Потім в яйцеклітину вкладається диплоїдне ядро з клітини тіла другої особини - донора. Потім яйцеклітина стимулюється до поділу так, щоб розвиток тривало. Це звучить просто, але насправді потрібно багато спроб, перш ніж кожен з кроків буде успішно завершений.

Першим клонованим сільськогосподарським твариною стала Доллі, вівця, яка народилася в 1996 році. Показник успішності репродуктивного клонування в той час був дуже низьким. Доллі прожила шість років і померла від пухлини легенів. Існували припущення, що оскільки клітинна ДНК, яка породила Доллі, походить від старшої людини, вік ДНК, можливо, вплинув на її тривалість життя. Починаючи з Доллі, кілька видів тварин (таких як коні, бики та кози) були успішно клоновані.

На ілюстрації показані кроки клонування овець на ім'я Доллі. Енуклейована яйцеклітина однієї вівці злита з молочною клітиною іншої вівці. Потім ця злита клітина ділиться на стадію бластоцисти і поміщається в матку сурогатної еви, де вона розвивається в ягню Доллі. Доллі - генетичний клон донора молочних клітин. — **Малюнок\(\PageIndex{4}\):** Створення Доллі, клонованої вівці.

Були спроби виробляти клоновані ембріони людини як джерела ембріональних стовбурових клітин. При процедурі ДНК дорослої людини вводиться в яйцеклітину людини, яка потім стимулюється до поділу. Технологія схожа на технологію, яка використовувалася для виробництва Доллі, але ембріон ніколи не імплантується сурогатної матері. Вироблені клітини називаються ембріональними стовбуровими клітинами, оскільки вони мають здатність розвиватися в багато різних видів клітин, таких як м'язові або нервові клітини. Стовбурові клітини можуть бути використані для дослідження і, зрештою, забезпечують терапевтичні програми, такі як заміна пошкоджених тканин. Перевага клонування в цьому випадку полягає в тому, що клітини, що використовуються для регенерації нових тканин, будуть ідеально відповідати донору вихідної ДНК. Наприклад, хворий на лейкемію не вимагатиме брата з сірником тканини для трансплантації кісткового мозку.

Запит\(\PageIndex{1}\)

Activity

Посилання

Якщо не зазначено інше, зображення на цій сторінці ліцензуються відповідно до CC-BY 4.0 OpenStax.

OpenStax, Біологія. OpenStax CNX. 27 травня 2016 р. http://cnx.org/contents/s8Hh0oOc@9.10:8CA_YwJq@3/Cloning-and-Genetic-Engineerin