Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

17.1: Біотехнологія

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    1848

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Навички для розвитку

    • Опишіть гелевий електрофорез
    • Поясніть молекулярне та репродуктивне клонування
    • Охарактеризуйте використання біотехнології в медицині та сільському господарстві

    Біотехнологія - це використання біологічних агентів для технологічного прогресу. Біотехнологія використовувалася для розведення худоби та сільськогосподарських культур задовго до того, як була зрозуміла наукова основа цих методик. З моменту відкриття структури ДНК в 1953 році сфера біотехнології швидко зростала як завдяки академічним дослідженням, так і приватним компаніям. Основне застосування цієї технології - в медицині (виробництво вакцин та антибіотиків) та сільському господарстві (генетична модифікація сільськогосподарських культур, наприклад, для підвищення врожайності). Біотехнологія також має багато промислових застосувань, таких як бродіння, обробка розливів нафти та виробництво біопалива (рис.\(\PageIndex{1}\)).

    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Антибіотики - це хімічні речовини, що виробляються грибками, бактеріями та іншими організмами, які мають антимікробні властивості Першим виявленим антибіотиком став пеніцилін. Антибіотики в даний час комерційно виробляються і тестуються на їх потенціал для пригнічення росту бактерій. (кредитна «реклама»: модифікація роботи NIH; кредитна «тестова табличка»: модифікація роботи Дона Сталонса/CDC; дані шкали від Метта Рассела)

    Основні методи маніпулювання генетичним матеріалом (ДНК та РНК)

    Щоб зрозуміти основні методи, що використовуються для роботи з нуклеїновими кислотами, пам'ятайте, що нуклеїнові кислоти - це макромолекули, виготовлені з нуклеотидів (цукру, фосфату та азотистої основи), пов'язаних фосфодіефірними зв'язками. Фосфатні групи на цих молекулах мають чистий негативний заряд. Весь набір молекул ДНК в ядрі називається геномом. ДНК має дві взаємодоповнюючі нитки, пов'язані водневими зв'язками між парними основами. Дві нитки можуть бути розділені під впливом високих температур (денатурація ДНК) і можуть бути відпалені охолодженням. ДНК може бути реплікована ферментом ДНК-полімерази. На відміну від ДНК, яка знаходиться в ядрі еукаріотичних клітин, молекули РНК залишають ядро. Найпоширенішим типом РНК, який аналізується, є месенджерна РНК (мРНК), оскільки вона представляє гени, що кодують білок, які активно експресуються. Однак молекули РНК створюють деякі інші проблеми для аналізу, оскільки вони часто менш стабільні, ніж ДНК.

    Екстракція ДНК та РНК

    Для вивчення або маніпулювання нуклеїновими кислотами ДНК або РНК спочатку повинні бути виділені або витягнуті з клітин. Для вилучення різних типів ДНК використовуються різні методики (рис.\(\PageIndex{2}\)). Більшість методів екстракції нуклеїнових кислот передбачають кроки для розриву клітини та використання ферментативних реакцій для знищення всіх макромолекул, які не бажані (наприклад, деградація небажаних молекул та відділення від зразка ДНК). Клітини розбиваються за допомогою буфера лізису (розчин, який в основному є миючим засобом); лізис означає «розщеплюватися». Ці ферменти розщеплюють ліпідні молекули в клітинних мембранах і ядерних мембранах. Макромолекули інактивуються за допомогою ферментів, таких як протеази, що розщеплюють білки, і рибонуклеази (РНК), які розщеплюють РНК. Потім ДНК осаджується за допомогою спирту. Геномна ДНК людини зазвичай видно як желатинова біла маса. Зразки ДНК можуть зберігатися замороженими при -80° C протягом декількох років.

    На цій ілюстрації показані чотири основні етапи екстракції ДНК. На першому етапі клітини в пробірці лізуються за допомогою миючого засобу, який порушує плазмову мембрану. На другому етапі вміст клітин обробляють протеазою для руйнування білка, а РНК - для руйнування РНК. Отриману суспензію центрифугують для гранулювання залишків клітин. Супернатант, або рідина, що містить ДНК, потім переноситься в чисту пробірку. ДНК осаджується етанолом. Утворює в'язкі, схожі на слизову пасма, які можна намотати на скляний стрижень
    Малюнок\(\PageIndex{2}\): На цій схемі показаний основний метод, який використовується для вилучення ДНК.

    Аналіз РНК проводиться для вивчення закономірностей експресії генів в клітині. РНК, природно, дуже нестабільна, оскільки РНК зазвичай присутні в природі і їх дуже важко інактивувати. Подібно до ДНК, екстракція РНК передбачає використання різних буферів та ферментів для інактивації макромолекул та збереження РНК.

    Гелевий електрофорез

    Оскільки нуклеїнові кислоти є негативно зарядженими іонами при нейтральному або основному рН у водному середовищі, вони можуть бути мобілізовані електричним полем. Гелевий електрофорез - це методика, яка використовується для поділу молекул на основі розміру, використовуючи цей заряд. Нуклеїнові кислоти можуть бути розділені як цілі хромосоми або фрагменти. Нуклеїнові кислоти завантажуються в щілину біля негативного електрода напівтвердої пористої гелевої матриці і тягнуться до позитивного електрода на протилежному кінці гелю. Менші молекули рухаються крізь пори в гелі швидше, ніж більші молекули; ця різниця в швидкості міграції відокремлює фрагменти виходячи з розміру. Існують стандартні зразки молекулярної маси, які можна запустити поряд з молекулами, щоб забезпечити порівняння розмірів. Нуклеїнові кислоти в гелевій матриці можна спостерігати за допомогою різних флуоресцентних або кольорових барвників. Виражені фрагменти нуклеїнової кислоти з'являються у вигляді смуг на певних відстанях від верхньої частини гелю (кінець негативного електрода) виходячи з їх розміру (рис.\(\PageIndex{3}\)). Суміш геномних фрагментів ДНК різного розміру з'являється у вигляді довгого мазка, тоді як необрізана геномна ДНК зазвичай занадто велика, щоб пройти через гель і утворює єдину велику смугу у верхній частині гелю.

    На фото зображений гель агарози, освітлений під ультрафіолетом. Гель містить дев'ять смуг зліва направо. Кожна смуга була завантажена зразком, що містить фрагменти ДНК різного розміру, які відокремлювалися, коли вони проходили через гель зверху вниз. ДНК виглядає у вигляді тонких білих смуг на чорному тлі. Смуги один і дев'ять містять багато смуг зі стандарту ДНК. Ці смуги тісно розташовані до вершини і розташовані далі далі вниз по гелю. Смуги від двох до восьми містять одну або дві смуги кожна. Деякі з цих смуг ідентичні за розміром і проходять однакову відстань в гель. Інші пробігають трохи іншу відстань, вказуючи на невелику різницю в розмірах.
    Малюнок\(\PageIndex{3}\): Показані фрагменти ДНК з семи зразків, запущених на гелі, забарвлені флуоресцентним барвником і переглянуті під ультрафіолетовим світлом. (кредит: Джеймс Джейкоб, Громадський коледж Томпкінса Кортленда)

    Ампліфікація фрагментів нуклеїнових кислот полімеразною ланцюговою реакцією

    Хоча геномна ДНК видно неозброєним оком, коли вона витягується навалом, аналіз ДНК часто вимагає зосередження уваги на одній або декількох конкретних областях генома. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це методика, яка використовується для ампліфікації конкретних областей ДНК для подальшого аналізу (рис.\(\PageIndex{4}\)). ПЛР використовується для багатьох цілей у лабораторіях, таких як клонування фрагментів генів для аналізу генетичних захворювань, ідентифікація забруднюючої чужорідної ДНК у зразку та ампліфікація ДНК для секвенування. Більш практичне застосування включає визначення батьківства та виявлення генетичних захворювань.

    На ілюстрації показано ампліфікацію послідовності ДНК полімеразною ланцюговою реакцією. ПЛР складається з трьох етапів - денатурації, відпалу та синтезу ДНК, які відбуваються при високих, низьких та проміжних температурах. На етапі 1, стадії денатурації, зразок нагрівається до високої температури, тому нитки ДНК відокремлюються. На етапі 2, відпал, зразок охолоджується, щоб два праймери могли відпалити до двох ниток ДНК. Грунтовки розставлені таким чином, що послідовність інтересів між ними буде посилюватися. На етапі 3, синтез ДНК, зразок розігрівається до оптимальної температури для полімерази Taq, яка синтезує комплементарну нитку від праймера до 3' кінця молекули. Цей цикл повторюється знову і знову. Щоразу новосинтезовані нитки служать шаблонами, щоб кількість ДНК подвоювалася з кожним циклом. У міру продовження циклів все більше і більше пасом мають розмір відстані між двома праймерами; врешті-решт, переважна більшість пасом мають такий розмір.
    Малюнок\(\PageIndex{4}\): Полімеразна ланцюгова реакція, або ПЛР, використовується для ампліфікації певної послідовності ДНК. Праймери - короткі шматочки ДНК, що доповнюють кожен кінець цільової послідовності - поєднуються з геномною ДНК, полімеразою Taq та дезоксинуклеотидами. Полімераза Taq - це ДНК-полімераза, виділена з термостабільної бактерії Thermus aquaticus, яка здатна витримувати високі температури, використовувані в ПЛР. Thermus aquaticus росте в басейні Нижнього Гейзера Єллоустонського національного парку. ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) схожа на ПЛР, але кДНК виготовляється з шаблону РНК до початку ПЛР.

    Фрагменти ДНК також можуть бути ампліфіковані з шаблону РНК у процесі, який називається ПЛР зворотної транскриптази (ЗТ-ПЛР). Першим кроком є відтворення вихідної ланцюга шаблону ДНК (званої кДНК) шляхом застосування нуклеотидів ДНК до мРНК. Цей процес називається зворотною транскрипцією. Для цього потрібна наявність ферменту під назвою зворотна транскриптаза. Після того, як кДНК зроблена, для її ампліфікації можна використовувати звичайну ПЛР.

    Посилання на навчання

    Поглибте своє розуміння полімеразної ланцюгової реакції, натиснувши цю інтерактивну вправу.

    Гібридизація, південний блоттинг та північний блоттинг

    Зразки нуклеїнових кислот, такі як фрагментовані геномні ДНК та екстракти РНК, можуть бути досліджені на наявність певних послідовностей. Короткі фрагменти ДНК, які називаються зондами, розроблені та марковані радіоактивними або флуоресцентними барвниками для полегшення Гелевий електрофорез відокремлює фрагменти нуклеїнової кислоти відповідно до їх розміру. Потім фрагменти в гелі переносяться на нейлонову мембрану в процедурі, яка називається промокання (рис.\(\PageIndex{5}\)). Фрагменти нуклеїнової кислоти, які пов'язані з поверхнею мембрани, потім можуть бути промацуються за допомогою специфічних радіоактивно або флуоресцентно маркованих послідовностей зондів. Коли ДНК переноситься на нейлонову мембрану, методика називається Південним блоттінгом, а коли РНК переноситься на нейлонову мембрану, вона називається північним блоттінгом. Південні плями використовуються для виявлення наявності певних послідовностей ДНК в даному геномі, а північні плями використовуються для виявлення експресії генів.

    При південному блоттингу ДНК відокремлюється на основі розміру агарозним гелевим електрофорезом. Фрагменти пробігають по гелю зверху вниз. У гелі, показаному на цьому малюнку, є стільки фрагментів ДНК, що вони з'являються у вигляді мазка в кожній смузі. ДНК з гелю переноситься на нейлонову мембрану. Для цього гель затискають між фільтрувальним папером і мембраною і поміщають у буфер гібридизації. Паперові рушники над гелевим гнітом піднімають вологу і допомагають у перенесенні. Нейлонова мембрана потім інкубується з радіоактивно або флуоресцентно маркованим зондом, який доповнює послідовність інтересів. Дискретні смуги з'являються там, де знаходиться цікавить послідовність.
    Малюнок\(\PageIndex{5}\): Південний блоттинг використовується для знаходження певної послідовності в зразку ДНК. Фрагменти ДНК відокремлюються на гелі, переносяться на нейлонову мембрану і інкубуються за допомогою ДНК-зонда, що доповнює цікавить послідовність. Північний блоттинг схожий на південний блоттинг, але РНК запускається на гелі замість ДНК. При західному блоттингу білки запускаються на гелі і виявляються за допомогою антитіл.

    Молекулярне клонування

    Взагалі, слово «клонування» означає створення досконалої репліки, однак в біології відродження цілого організму називають «репродуктивним клонуванням». Задовго до того, як були зроблені спроби клонувати цілий організм, дослідники навчилися відтворювати бажані області або фрагменти генома, процес, який називають молекулярним клонуванням.

    Клонування дрібних фрагментів генома дозволяє маніпулювати і вивчати конкретні гени (і їх білкові продукти), або некодують області ізольовано. Плазміда (також називається вектором) - це невелика кругова молекула ДНК, яка реплікується незалежно від хромосомної ДНК. При клонуванні молекули плазміди можуть бути використані для надання «папки», в яку можна вставити потрібний фрагмент ДНК. Плазміди зазвичай вводяться бактеріальному господареві для проліферації. У бактеріальному контексті фрагмент ДНК з генома людини (або генома іншого досліджуваного організму) називають чужорідною ДНК або трансгеном, щоб диференціювати його від ДНК бактерії, яка називається ДНК господаря.

    Плазміди зустрічаються природним шляхом у бактеріальних популяціях (таких як кишкова паличка) і мають гени, які можуть сприяти сприятливим рисам організму, таким як резистентність до антибіотиків (здатність не впливати на антибіотики). Плазміди були перероблені та розроблені як вектори для молекулярного клонування та великомасштабного виробництва важливих реагентів, таких як інсулін та гормон росту людини. Важливою особливістю плазмідних векторів є легкість, з якою чужорідний фрагмент ДНК може бути введений через сайт багаторазового клонування (MCS). MCS - це коротка послідовність ДНК, що містить кілька ділянок, які можна вирізати різними загальнодоступними ендонуклеазами рестрикції. Рестрикційні ендонуклеази розпізнають конкретні послідовності ДНК і розрізають їх передбачуваним чином; вони природним чином виробляються бактеріями як захисний механізм проти чужорідної ДНК. Багато рестрикційні ендонуклеази роблять шахові надрізи в двох нитках ДНК, такі, що зрізані кінці мають 2- або 4-базовий одножильний звис. Оскільки ці звіси здатні відпалювати з додатковими свесами, їх називають «липкими кінцями». Додавання ферменту під назвою ДНК-лігаза постійно приєднується до фрагментів ДНК через фосфодіефірні зв'язки. Таким чином, будь-який фрагмент ДНК, утворений рестрикційним розщепленням ендонуклеази, може бути з'єднаний між двома кінцями плазмідної ДНК, яка була розрізана з однаковою рестрикційною ендонуклеазою (рис.\(\PageIndex{6}\)).

    Рекомбінантні молекули ДНК

    Плазміди з введеними в них чужорідними ДНК називаються рекомбінантними молекулами ДНК, оскільки вони створені штучно і не зустрічаються в природі. Їх також називають химерними молекулами, оскільки походження різних частин молекул можна простежити до різних видів біологічних організмів або навіть до хімічного синтезу. Білки, які експресуються з рекомбінантних молекул ДНК, називаються рекомбінантними білками. Не всі рекомбінантні плазміди здатні експресувати гени. Рекомбінантну ДНК, можливо, доведеться перемістити в інший вектор (або господар), який краще призначений для експресії генів. Плазміди також можуть бути розроблені для експресії білків лише при стимулюванні певними факторами навколишнього середовища, щоб вчені могли контролювати експресію рекомбінантних білків.

    Мистецтво З'єднання

    Малюнок ілюструє кроки молекулярного клонування в плазміду, яка називається клонуючим вектором. Вектор має ген LacZ, який необхідний для метаболізації лактози, і ген стійкості до ампіциліну. У гені LaCZ знаходяться місця рестрикції, послідовності ДНК, розрізані певним рестрикційним ферментом. ДНК, що підлягає клонуванню, і плазміда вирізаються одним і тим же рестрикційним ферментом. Фермент рестрикції хитить розрізи на двох нитках ДНК, таким чином, що кожна нитка має нависає однонитковий біт ДНК. На одній пасмі послідовність начісування - GATC, а на іншій послідовність - CTAG. Ці дві послідовності є взаємодоповнюючими і дозволяють фрагменту чужорідної ДНК відпалювати плазмідою. Фермент під назвою лігаза з'єднує дві частини разом. Потім лігована плазміда перетворюється в бактеріальний штам, якому не вистачає гена LacZ і чутливий до антибіотика ампіциліну. Бактерії наносяться на середовища, що містять ампіцилін, так що будуть рости лише бактерії, які взяли плазміду (яка має ген стійкості до ампіциліну). Засоби масової інформації також містять X-gal, хімічну речовину, яка метаболізується так само, як лактоза. Плазміди, які не мають вставки, здатні метаболізувати X-gal, вивільняючи барвник з X-gal, який перетворює колонію в синій колір. Плазміди з вставкою мають порушений ген LaCZ і продукують білі колонії. Таким чином, колонії, що містять клоновану ДНК, можна підбирати виходячи з кольору.
    Малюнок\(\PageIndex{6}\): Ця діаграма показує кроки, що беруть участь у молекулярному клонуванні.

    Ви працюєте в лабораторії молекулярної біології, і, невідомо вам, ваш партнер лабораторії залишив іноземну геномну ДНК, яку ви плануєте клонувати на лабораторному стенді протягом ночі, замість того, щоб зберігати її в морозильній камері. В результаті він деградувався нуклеазами, але все ж використовувався в експерименті. Плазміда, з іншого боку, добре. Які результати ви очікуєте від експерименту з молекулярного клонування?

    1. Колоній на бактеріальної пластинці не буде.
    2. Будуть тільки сині колонії.
    3. Будуть сині і білі колонії.
    4. Будуть тільки білі колонії.

    Посилання на навчання

    Переглянути анімацію рекомбінації при клонуванні з навчального центру ДНК.

    Клітинне клонування

    Одноклітинні організми, такі як бактерії та дріжджі, природним чином виробляють клони себе, коли вони розмножуються безстатевим шляхом бінарного поділу; це відомо як клітинне клонування. Ядерна ДНК дублюється процесом мітозу, що створює точну копію генетичного матеріалу.

    репродуктивне клонування

    Репродуктивне клонування - це метод, який використовується для створення клону або ідентичної копії всього багатоклітинного організму. Більшість багатоклітинних організмів піддаються розмноженню статевим шляхом, що передбачає генетичну гібридизацію двох особин (батьків), що робить неможливим генерацію ідентичної копії або клону будь-якого з батьків. Останні досягнення в біотехнології дозволили штучно індукувати безстатеве розмноження ссавців в лабораторії.

    Партеногенез, або «дівоче народження», відбувається, коли ембріон росте і розвивається без запліднення яйцеклітини; це форма безстатевого розмноження. Приклад партеногенезу зустрічається у видів, у яких самка відкладає яйцеклітину, а якщо яйцеклітина запліднена, це диплоїдна яйцеклітина, а особина розвивається в самку; якщо яйцеклітина не запліднена, вона залишається гаплоїдної яйцеклітиною і розвивається в самця. Незапліднену яйцеклітину називають партеногенной, або незайманою яйцеклітиною. Деякі комахи і плазуни відкладають партеногенні ікри, які можуть перерости в дорослих особин.

    Статеве розмноження вимагає двох клітин; коли гаплоїдна яйцеклітина та сперматозоїди зливаються, виникає диплоїдна зигота. Ядро зиготи містить генетичну інформацію для отримання нової особини. Однак для раннього ембріонального розвитку потрібен цитоплазматичний матеріал, що міститься в яйцеклітині. Ця ідея є основою для репродуктивного клонування. Тому, якщо гаплоїдне ядро яйцеклітини замінити диплоїдним ядром з клітини будь-якої особини одного виду (званого донором), воно стане генетично ідентичною донору зиготою. Ядерний перенос соматичних клітин - це техніка перенесення диплоїдного ядра в енуклейовану яйцеклітину. Його можна використовувати як для терапевтичного клонування, так і для репродуктивного клонування.

    Першим клонованим твариною стала Доллі, вівця, яка народилася в 1996 році. Показник успішності репродуктивного клонування в той час був дуже низьким. Доллі прожила сім років і померла від респіраторних ускладнень (рис. 17.1.7). Є припущення, що оскільки клітинна ДНК належить старшій особі, вік ДНК може впливати на тривалість життя клонованої особини. Починаючи з Доллі, кілька тварин, таких як коні, бики та кози, були успішно клоновані, хоча ці особи часто виявляють аномалії обличчя, кінцівок та серця. Були спроби виробляти клоновані ембріони людини як джерела ембріональних стовбурових клітин, які іноді називають клонуванням для терапевтичних цілей. Терапевтичне клонування виробляє стовбурові клітини, щоб спробувати виправити згубні захворювання або дефекти (на відміну від репродуктивного клонування, яке спрямоване на відтворення організму). Тим не менш, терапевтичні зусилля клонування зустрілися з резистентністю через біоетичні міркування.

    Мистецтво З'єднання

    Для клонування овець Доллі в якості донора цитоплазми використовували шотландську вівцю Blackface. Яйця з цієї овець витягували, а ядро видаляли. Як ядерний донор використовували вівцю Фінн-Дорсет. Ядра витягувалися з молочних клітин, а постійний електричний струм використовувався для злиття ядерної ДНК з донорською яйцеклітиною. Потім яйцеклітину дозволили ділитися до стадії бластоцисти, в якій сфера клітин містить скупчення клітин з одного боку. Бластоциста була імплантована сурогатній матері, в результаті чого вівці Доллі.
    Малюнок\(\PageIndex{7}\): Вівця Доллі була першим ссавцем, якого клонували. Для створення Доллі ядро було видалено з донорської яйцеклітини. Потім ядро від другої овець було введено в клітину, якій дозволили розділити на стадію бластоцисти перед імплантацією сурогатної матері. (кредит: модифікація роботи «Скідоній» /Wikimedia Commons)

    Як ви думаєте, Доллі була Фінн-Дорсет або шотландська вівця Blackface?

    Генна інженерія

    Генна інженерія - це зміна генотипу організму за допомогою технології рекомбінантної ДНК для модифікації ДНК організму для досягнення бажаних ознак. Додавання чужорідної ДНК у вигляді рекомбінантних векторів ДНК, що генеруються молекулярним клонуванням, є найпоширенішим методом генної інженерії. Організм, який отримує рекомбінантну ДНК, називається генетично модифікованим організмом (ГМО). Якщо чужорідна ДНК, яка вводиться, походить від іншого виду, організм-господар називається трансгенним. Бактерії, рослини та тварини були генетично модифіковані з початку 1970-х років для академічних, медичних, сільськогосподарських та промислових цілей. У США ГМО, такі як соєві боби, готові до округлення та кукурудза, стійка до буріння, є частиною багатьох поширених перероблених харчових продуктів.

    Націлювання на гени

    Хоча класичні методи вивчення функції генів починалися з даного фенотипу і визначали генетичну основу цього фенотипу, сучасні методики дозволяють дослідникам почати з рівня послідовності ДНК і запитати: «Що робить цей ген або елемент ДНК?» Ця методика, яка називається зворотною генетикою, призвела до скасування класичної генетичної методології. Цей метод був би схожий на пошкодження частини тіла для визначення її функції. Комаха, що втрачає крило, не може літати, а значить, функція крила - політ. Класичний генетичний метод порівняв би комах, які не можуть літати, з комахами, які можуть літати, і спостерігати, що нелітаючі комахи втратили крила. Аналогічно, мутація або видалення генів дає дослідникам підказки про функцію генів. Методи, що використовуються для відключення функції генів, в сукупності називаються генним таргетингом. Націлювання на гени - це використання рекомбінантних векторів ДНК для зміни експресії певного гена, або шляхом введення мутацій в ген, або шляхом усунення експресії певного гена шляхом видалення частини або всієї послідовності генів з генома організму.

    Біотехнології в медицині та сільському господарстві

    Неважко помітити, як біотехнології можна використовувати в лікувальних цілях. Знання генетичного складу нашого виду, генетичної основи спадкових захворювань та винахід технології маніпулювання та фіксації мутантних генів забезпечує методи лікування захворювання. Біотехнологія в сільському господарстві може підвищити стійкість до хвороб, шкідників та екологічного стресу, а також покращити врожайність та якість сільськогосподарських культур.

    Генетична діагностика та генна терапія

    Процес тестування на підозру на генетичні дефекти перед призначенням лікування називається генетичною діагностикою шляхом генетичного тестування. Залежно від закономірностей успадкування хвороботворного гена членам сім'ї рекомендується пройти генетичне тестування. Наприклад, жінкам з діагнозом рак молочної залози зазвичай радять зробити біопсію, щоб медична команда могла визначити генетичну основу розвитку раку. Плани лікування засновані на висновках генетичних тестів, які визначають тип раку. Якщо рак викликаний успадкованими генними мутаціями, іншим родичам жіночої статі також рекомендується пройти генетичне тестування та періодичний скринінг на рак молочної залози. Також пропонується генетичне тестування для плодів (або ембріонів з екстракорпоральним заплідненням) для визначення наявності або відсутності хвороботворних генів у сім'ях із специфічними виснажливими захворюваннями.

    Генна терапія - це методика генної інженерії, яка використовується для лікування хвороби. У найпростішій формі він передбачає введення хорошого гена у випадковому місці в геному, щоб допомогти вилікувати захворювання, яке викликається мутованим геном. Хороший ген зазвичай вводиться в хворі клітини як частина переносника, що передається вірусом, який може заразити клітину господаря і доставити чужорідну ДНК (рис.\(\PageIndex{8}\)). Більш просунуті форми генної терапії намагаються виправити мутацію на вихідному місці в геному, як це відбувається при лікуванні важкого комбінованого імунодефіциту (SCID).

    Щоб вилікувати захворювання за допомогою вектора аденовірусу, новий ген, призначений для заміни дефектного, упаковується з геном аденовірусу. Гени, які роблять вірус патогенним, видаляються. Модифікована ДНК поміщається всередину капсиду вірусу, або білкової оболонки. Людина, яку потрібно вилікувати, заражений модифікованим вірусом. Вірусна ДНК потрапляє в ядро, де модифікований ген може замінити дефектний.
    Малюнок\(\PageIndex{8}\): Генна терапія з використанням аденовірусного вектора може бути використана для лікування певних генетичних захворювань, при яких у людини є дефектний ген. (Кредит: NIH)

    Виробництво вакцин, антибіотиків та гормонів

    Традиційні стратегії вакцинації використовують ослаблені або неактивні форми мікроорганізмів для посилення початкової імунної відповіді. Сучасні методики використовують гени мікроорганізмів, клонованих в вектори, для масового вироблення потрібного антигену. Потім антиген вводять в організм, щоб стимулювати первинну імунну відповідь і викликати імунну пам'ять. Для боротьби з постійно мінливими штамами цього вірусу були використані гени, клоновані від вірусу грипу.

    Антибіотики - біотехнологічний продукт. Вони природним чином виробляються мікроорганізмами, такими як гриби, щоб досягти переваги перед бактеріальними популяціями. Антибіотики виробляються у великих масштабах шляхом культивування та маніпулювання грибковими клітинами.

    Рекомбінантна технологія ДНК була використана для отримання великої кількості людського інсуліну в кишковій паличці ще в 1978 році. Раніше лікувати діабет можна було лише свинячим інсуліном, який викликав алергічні реакції у людини через відмінності в генному продукті. Крім того, гормон росту людини (HGH) використовується для лікування порушень росту у дітей. Ген HGH був клонований з бібліотеки кДНК і вставлений в E. coli клітини шляхом клонування його в бактеріальний вектор.

    Трансгенні тварини

    Хоча кілька рекомбінантних білків, що використовуються в медицині, успішно виробляються в бактеріях, деякі білки вимагають еукаріотичного тваринного господаря для правильної обробки. З цієї причини бажані гени клонуються та виражаються у тварин, таких як вівці, кози, кури та миші. Тварини, які були модифіковані для експресії рекомбінантної ДНК, називаються трансгенними тваринами. Кілька людських білків експресуються в молоці трансгенних овець і кіз, а деякі - в яйцях курей. Миші широко використовуються для експресії та вивчення ефектів рекомбінантних генів та мутацій.

    Трансгенні рослини

    Маніпулювання ДНК рослин (тобто створення ГМО) допомогло створити бажані ознаки, такі як стійкість до хвороб, стійкість до гербіцидів та пестицидів, краща харчова цінність та кращий термін зберігання (рис.\(\PageIndex{9}\)). Рослини є найважливішим джерелом їжі для людського населення. Фермери розробили способи відбору сортів рослин з бажаними ознаками задовго до того, як були налагоджені сучасні біотехнологічні практики.

    Фото демонструє кукурудзяні качани з різними кольорами, включаючи жовтий, білий, червоний, і суміш цих кольорів.
    Малюнок\(\PageIndex{9}\): Кукурудза, основна сільськогосподарська культура, яка використовується для створення продуктів для різних галузей промисловості, часто модифікується за допомогою біотехнології рослин. (кредит: Кіт Веллер, USDA)

    Рослини, які отримали рекомбінантну ДНК від інших видів, називають трансгенними рослинами. Оскільки вони не є природними, трансгенні рослини та інші ГМО ретельно контролюються державними установами, щоб переконатися, що вони придатні для споживання людиною та не загрожують іншим рослинним та тваринним тваринам. Оскільки чужорідні гени можуть поширюватися на інші види в навколишньому середовищі, для забезпечення екологічної стабільності потрібні великі випробування. Такі скоби, як кукурудза, картопля та помідори, були першими сільськогосподарськими рослинами, які були генетично інженерними.

    Трансформація рослин за допомогою Agrobacterium tumefaciens

    Перенесення генів відбувається природним шляхом між видами в мікробних популяціях. Багато вірусів, що викликають захворювання людини, такі як рак, діють шляхом включення їх ДНК в геном людини. У рослин пухлини, викликані бактерією Agrobacterium tumefaciens, відбуваються шляхом перенесення ДНК від бактерії до рослини. Хоча пухлини не вбивають рослини, вони роблять рослини низькорослими і більш сприйнятливими до суворих умов навколишнього середовища. Багато рослин, такі як волоські горіхи, виноград, горіхи та буряк, уражаються A. tumefaciens. Штучне введення ДНК в рослинні клітини є більш складним, ніж в клітині тварин, через товсту клітинну стінку рослин.

    Дослідники використовували природний перенос ДНК від Agrobacterium до рослинного господаря для введення фрагментів ДНК за їх вибором у господарів рослин. У природі хвороботворні A. tumefaciens мають набір плазмід, званих плазмідами Ti (пухлиноіндукуючі плазміди), які містять гени для виробництва пухлин у рослин. ДНК з плазміди Ti інтегрується в геном зараженої рослинної клітини. Дослідники маніпулюють плазмідами Ti, щоб видалити гени, що викликають пухлину, і вставити потрібний фрагмент ДНК для перенесення в геном рослини. Плазміди Ti несуть гени резистентності до антибіотиків для сприяння відбору, а також можуть розмножуватися в клітині кишкової палички.

    Органічний інсектицид Bacillus thuringiensis

    Bacillus thuringiensis (Bt) - бактерія, яка виробляє кристали білка під час споролювання, токсичні для багатьох видів комах, які вражають рослини. Bt токсин повинен потрапляти комахами, щоб токсин активувався. Комахи, які з'їли Bt токсин, перестають харчуватися рослинами протягом декількох годин. Після того як токсин активізується в кишечнику комах, смерть настає протягом пари днів. Сучасна біотехнологія дозволила рослинам закодувати власний кристалічний Bt токсин, який діє проти комах. Гени кристалічного токсину були клоновані з Bt і введені в рослини. Було виявлено, що токсин Bt є безпечним для навколишнього середовища, нетоксичним для людей та інших ссавців і схвалений для використання органічними фермерами як природний інсектицид.

    Смак Savr Томатний

    Перший ГМ урожай, який буде введений на ринок був Flavr Savr томатний, вироблений в 1994 році. Технологія Antisense РНК використовувалася для уповільнення процесу розм'якшення і гниття, викликаного грибковими інфекціями, що призвело до збільшення терміну зберігання томатів ГМ. Додаткова генетична модифікація поліпшила смак цього томата. Томат Flavr Savr не успішно залишився на ринку через проблеми зі збереженням та доставкою врожаю.

    Резюме

    Нуклеїнові кислоти можуть бути виділені з клітин з метою подальшого аналізу, розбиваючи клітини і ферментативно знищуючи всі інші основні макромолекули. Фрагментовані або цілі хромосоми можна розділити за розміром гелевим електрофорезом. Короткі розтяжки ДНК або РНК можуть бути ампліфіковані методом ПЛР. Південний і північний блоттинг може бути використаний для виявлення наявності специфічних коротких послідовностей у зразку ДНК або РНК. Термін «клонування» може стосуватися клонування дрібних фрагментів ДНК (молекулярне клонування), клонування популяцій клітин (клітинне клонування) або клонування цілих організмів (репродуктивне клонування). Генетичне тестування проводиться для виявлення хвороботворних генів, а генна терапія використовується для лікування успадкованого захворювання.

    Трансгенні організми мають ДНК різних видів, зазвичай генеруються методами молекулярного клонування. Вакцини, антибіотики та гормони є прикладами продуктів, отриманих за технологією рекомбінантної ДНК. Трансгенні рослини зазвичай створюються для поліпшення характеристик сільськогосподарських рослин.

    Мистецькі зв'язки

    Малюнок\(\PageIndex{6}\): Ви працюєте в лабораторії молекулярної біології, і, невідомо вам, ваш партнер лабораторії залишив чужорідну геномну ДНК, яку ви плануєте клонувати на лавці лабораторії протягом ночі, замість того, щоб зберігати її в морозильній камері. В результаті він деградувався нуклеазами, але все ж використовувався в експерименті. Плазміда, з іншого боку, добре. Які результати ви очікуєте від експерименту з молекулярного клонування?

    1. Колоній на бактеріальної пластинці не буде.
    2. Будуть тільки сині колонії.
    3. Будуть сині і білі колонії.
    4. Будуть тільки білі колонії.
    Відповідь

    Б. експеримент призведе тільки до синіх колоній.

    Малюнок\(\PageIndex{7}\): Як ви думаєте, Доллі була фін-Дорсетом або шотландською вівцею Blackface?

    Відповідь

    Доллі була вівцею Фінн-Дорсет, тому що, хоча оригінальна клітина походила від шотландської овець з чорним обличчям, а сурогатна мати була шотландським чорним обличчям, ДНК походить від Фінн-Дорсет.

    Глосарій

    резистентність до антибіотиків
    здатність організму не впливати на дії антибіотика
    біотехнології
    використання біологічних агентів для технологічного прогресу
    клітинне клонування
    виробництво ідентичних клітинних популяцій шляхом бінарного поділу
    клон
    точна репліка
    чужорідна ДНК
    ДНК, яка належить до іншого виду, або ДНК, яка штучно синтезується
    гелевий електрофорез
    методика, яка використовується для поділу молекул на основі розміру за допомогою електричного заряду
    націлювання на гени
    метод зміни послідовності конкретного гена шляхом введення модифікованої версії на вектор
    генна терапія
    методика, яка використовується для лікування успадкованих захворювань шляхом заміни мутантних генів хорошими генами
    генетична діагностика
    діагностика потенціалу розвитку захворювання шляхом аналізу хвороботворних генів
    генна інженерія
    зміна генетичного складу організму
    генетичне тестування
    процес тестування на наявність хвороботворних генів
    генетично модифікований організм (ГМО)
    організм, геном якого був штучно змінений
    ДНК господаря
    ДНК, яка присутня в геному цікавить організму
    буфер лізису
    розчин, який використовується для розриву клітинної мембрани і вивільнення вмісту клітин
    молекулярне клонування
    клонування фрагментів ДНК
    багаторазове клонування сайту (MCS)
    сайт, який може бути розпізнаний по множинним обмеженням ендонуклеаз
    північний промокання
    перенесення РНК з гелю на нейлонову мембрану
    полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
    техніка, що використовується для ампліфікації ДНК
    зонд
    невеликий фрагмент ДНК, який використовується для визначення того, чи присутня комплементарна послідовність у зразку ДНК
    протеази
    фермент, що розщеплює білки
    рекомбінантна ДНК
    комбінація фрагментів ДНК, що генерується молекулярним клонуванням, якого немає в природі; також відома як химерна молекула
    рекомбінантний білок
    білковий продукт гена, отриманого шляхом молекулярного клонування
    репродуктивне клонування
    клонування цілих організмів
    обмеження ендонуклеази
    фермент, який може розпізнавати та розщеплювати специфічні послідовності ДНК
    зворотна генетика
    метод визначення функції гена, починаючи з самого гена, а не починаючи з генного продукту
    ПЛР з зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР)
    Метод ПЛР, який передбачає перетворення РНК в ДНК шляхом зворотної транскриптази
    рибонуклеаза
    фермент, що розщеплює РНК
    Південний блоттинг
    перенесення ДНК з гелю на нейлонову мембрану
    Ti плазміди
    плазмідна система, отримана з Agrobacterium tumifaciens, яка була використана вченими для введення чужорідної ДНК в рослинні клітини
    трансгенні
    організм, який отримує ДНК від різних видів