18: Генна інженерія

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6660

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Генна інженерія - це навмисне маніпулювання ДНК, використовуючи методи в лабораторії для зміни генів в організмах. Навіть якщо організми, що змінюються, не є мікробами, використовувані речовини і методи часто беруться від мікробів і пристосовані для використання в більш складних організмах.

Етапи клонування гена

Давайте пройдемося по основних етапах клонування гена, процесу, за допомогою якого цікавий ген може бути реплікований багато разів. Давайте зробимо вигляд, що ми збираємось генетично розробити клітини кишкової палички, щоб світитися в темряві, характеристикою, якою вони природно не володіють.

Виділити ДНК, що цікавить - спочатку нам потрібно визначити гени або гени, які нас цікавлять, цільову ДНК. Якщо ми хочемо, щоб наші клітини кишкової палички світилися в темряві, нам потрібно знайти організм, який володіє цією ознакою, і визначити ген або гени, відповідальні за цю рису. Зелений флуоресцентний білок (GFP), який зазвичай використовується як маркер експресії в молекулярних методах, спочатку був виділений з jellyfish.In клонування гена корисно використовувати вектор клонування, як правило, плазміду або вірус, здатний до незалежної реплікації, яка буде стабільно нести цільова ДНК з одного місця в інше. Плазмідні вектори доступні як від бактерій, так і від дріжджів.
Вирізати ДНК з рестрикційними ендонуклеазами - після ідентифікації цільової та векторної ДНК обидва типи ДНК вирізаються за допомогою рестрикційних ендонуклеаз. Ці ферменти розпізнають короткі послідовності ДНК, які мають довжину 4-8 bp. Ферменти широко поширені як у бактерій, так і в архей, причому кожен фермент визнає специфічну перевернуту послідовність повторення, яка є паліндромною (читається однаково на кожному ланцюжку ДНК, у напрямку від 5 до 3').

Обмеження ендонуклеаз.

Хоча деякі рестрикційні ендонуклеази розрізаються прямо поперек ДНК (тобто тупий зріз), багато хто робить шахові розрізи, утворюючи дуже коротку область однониткової ДНК на кожному пасмі. Ці однониткові області називаються «липкими кінцями» і є неоціненними при молекулярному клонуванні, оскільки непарні основи рекомбінуються з будь-якою ДНК, що має додаткову базову послідовність.
Об'єднати цільову та векторну ДНК - після того, як обидва типи ДНК були розщеплені однаковою рестрикційною ендонуклеазою, два типи ДНК поєднуються разом з додаванням ДНК-лігази, ферменту, який відновлює ковалентні зв'язки на цукрово-фосфатній кістці ДНК. Це призводить до створення рекомбінантної ДНК, молекул ДНК, які містять ДНК з двох або більше джерел, також відомих як химери.

Лігування.
Ввести рекомбіновану молекулу в клітину-господаря - як тільки цільова ДНК стабільно поєднується з векторною ДНК, рекомбінантна ДНК повинна бути введена в клітину-господаря, щоб гени були репліковані або експресовані. Існують різні методи введення рекомбінантної ДНК, багато в чому залежать від складності організму господаря. У випадку з бактеріями трансформація часто є найпростішим методом, використовуючи грамотні клітини для підбору рекомбінантних молекул ДНК. Крім того, може бути використана електропорація, де клітини піддаються короткому імпульсу високої напруги електрики, що призводить до того, що плазмова мембрана стає тимчасово проникною для проходження ДНК. У той час як деякі клітини придбають рекомбінантну ДНК з відповідною конфігурацією (тобто цільова ДНК комбінована з векторною ДНК), метод також дасть клітини, що несуть рекомбінантну ДНК з альтернативними комбінаціями ДНК (тобто плазмідна ДНК, що поєднується з іншою плазмідною молекулою ДНК або цільовою ДНК, прикріпленою до більш цільової ДНК). Суміш називається геномною бібліотекою і повинна бути екранована для вибору відповідного клону. Якщо спочатку використовувалися випадкові фрагменти ДНК (замість виділення відповідних генів-мішеней ДНК), процес називається клонуванням дробовика і може дати тисячі або десятки тисяч клонів для скринінгу.

Введення рекомбінантної ДНК в клітини, відмінні від бактерій

Агробактерія тумефаціенс і плазміда Ti

Пухлино-індукуюча плазміда.

Agrobacterium tumefaciens - це рослинний збудник, який викликає пухлинне утворення, яке називається хворобою коронкової жовчі. Бактерія містить плазміду, відому як плазміда Ti (індукування пухлини), яка вставляє бактеріальну ДНК в геном рослини-господаря. Вчені використовують цей природний процес для генної інженерії рослин шляхом введення чужорідної ДНК в плазміду Ti та видалення генів, необхідних для захворювання, що дозволяє виробляти трансгенні рослини.

Генний пістолет

Генна гармата використовує дуже дрібні металеві частинки (мікроснаряди), покриті рекомбінантною ДНК, які вибухають на рослинній або тваринній тканині з високою швидкістю. Якщо ДНК трансформується або засвоюється ДНК клітини, гени виражаються.

вірусні вектори

Для вірусного вектора гени вірулентності з вірусу можуть бути видалені та вставлені чужорідні ДНК, що дозволяє використовувати капсид вірусу як механізм переміщення генетичного матеріалу в рослинну або тваринну клітину. Зазвичай додаються маркерні гени, які дозволяють ідентифікувати клітини, які зайняли гени.

Методи ДНК

Гелевий електрофорез

Гелевий електрофорез - це методика, яка зазвичай використовується для поділу фрагментів нуклеїнової кислоти залежно від розміру. Він може бути використаний для ідентифікації певних фрагментів або для перевірки успішності техніки.

З агарози готують пористий гель, причому концентрацію регулюють залежно від очікуваного розміру. Зразки нуклеїнової кислоти осідають в лунки в гелі і подають електричний струм. Нуклеїнова кислота при своєму негативному заряді буде рухатися в бік позитивного електрода, який слід помістити на дно гелю. Нуклеїнова кислота буде рухатися через гель, причому найменші шматочки стикаються з найменшим опором і таким чином рухаються швидше за все. Довжину проходження кожного фрагмента нуклеїнової кислоти можна порівняти з драбинкою ДНК, з фрагментами відомого розміру.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Полімеразна ланцюгова реакція або ПЛР - це метод, який використовується для копіювання або ампліфікації ДНК in vitro. Процес може дати мільярдні копії одного гена за короткий проміжок часу. Шаблонна ДНК змішується з усіма інгредієнтами, необхідними для створення копій ДНК: праймерами (невеликими олігонуклеотидами, які оточують ген або гени, що цікавлять, розпізнаючи послідовності по обидва боки від нього), нуклеотиди (будівельні блоки ДНК) та ДНК-полімераза . Етапи включають нагрівання ДНК шаблону для денатурації або відокремлення ниток, зниження температури, щоб дати можливість відпалу праймерів, а потім нагрівання суміші, щоб дозволити ДНК-полімеразі розширити праймери, використовуючи оригінальну ДНК як початкову шаблон. Цикл повторюють 20-30 разів, експоненціально збільшуючи кількість цільової ДНК за кілька годин.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Ензоклоп (Власна робота) [CC BY-SA 3.0], через Вікісховище

Використання генно-інженерних організмів

Існує безліч причин для створення генетично модифікованого організму (ГМО) або трансгенного організму, визначеного як генетично модифікований організм, який містить ген з іншого організму. Як правило, надія полягає в тому, що ГМО надасть необхідну інформацію або продукт цінності для суспільства.

Джерело ДНК

Генетично інженерні організми можуть бути зроблені таким чином, що шматок ДНК може бути легко реплікований, забезпечуючи велике джерело цієї ДНК. Наприклад, ген, пов'язаний з раком молочної залози, може бути зрощений в геном кишкової палички, що дозволяє швидко виробляти ген, щоб він міг бути секвенований, вивчений і маніпульований, не вимагаючи повторних пожертвувань тканин від людських добровольців.

Джерело РНК

Антисенсова РНК - це ssRNA, яка доповнює мРНК, яка буде кодувати білок. У клітині він зроблений як спосіб контролю генів-мішеней. Збільшується інтерес до використання антисенсової РНК як способу профілактики захворювань, які викликані виробленням певного білка.

Антисенсова РНК. Робінсон Р [CC BY 2.5], через Вікісховище

Джерело білка

Оскільки мікроби так швидко розмножуються, їх може бути надзвичайно вигідно використовувати для виробництва білків, що представляють інтерес або цінність. Враховуючи правильні промотори, бактерії експресують гени для білків, які природним чином не містяться в бактеріях, таких як цитокіни. Генетично інженерні клітини були використані, щоб зробити широкий спектр білків використання для людини, таких як інсулін або людський гормон росту.

Ключові слова

генна інженерія, клонування, цільова ДНК, зелений флуоресцентний білок (GFP), клонуючий вектор, рестрикційна ендонуклеаза, липкі кінці, ДНК-лігаза, рекомбінантна ДНК, химера, перетворення, електропорація, генна бібліотека, клонування дробовика, Agrobacterium tumefaciens, Ti плазміда, генна гармата, мікроснаряди , вірусний вектор, гелевий електрофорез, ДНК-сходи, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), шаблонна ДНК, праймер, нуклеотид, ДНК-полімераза, денатурування, відпал, розширення, генетично модифікований організм (ГМО), трансгенні організми, антисенсова РНК.

Навчальні питання

Визначте генну інженерію.
Визначте та опишіть основні етапи, що використовуються в генній інженерії бактеріальної клітини. Які компоненти потрібні і навіщо?
Узагальнити різні способи введення рекомбінантної ДНК в клітину або організм. Вміти наводити конкретні приклади.
Опишіть прийоми, які використовуються при маніпуляції ДНК. Які основні складові кожного процесу?
Поясніть різні застосування генної інженерії.