9.11: Експресія генів, специфічних для клітин

Last updated
Save as PDF

Page ID: 5667

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

альт — Малюнок 9.11.2 Навіть пропущений ген люб'язно надано Пітером Лоуренсом та Блеквеллом Наукові публікації

Приклад: Зробити дрозофілу трансгенною для рекомбінантної ДНК, що містить:

ген Z для бета-галактозидази
парно-пропущений (напередодні), (інший ген гомеобкса).

Будь-яка клітина з факторами транскрипції для включення рівномірно пропущеного промотора почне робити бета-галактозидазу. З огляду на належний субстрат, фермент виробляє кольоровий продукт.

Наведена вище фотографія показує 7 смуг цього кольорового продукту, що ідентифікують клітини, які експресували навіть пропущений ген. Про цю подію «повідомив» ген LaCZ. Темні смуги 7 розкривають області, які чергуються з 7 смугами, утвореними клітинами, що виражають фуші-тарасу.

Зелений флуоресцентний білок (GFP)

У природі зелений флуоресцентний білок (GFP) виробляється, Aequorea victoria, тихоокеанська північно-західна медуза. Білок став представляти великий інтерес для клітинних і молекулярних біологів, оскільки він може виявити експресію генів в живих клітині.

Це робиться шляхом злиття гена для GFP з геном, експресія якого вас цікавить. Коли цей ген включається в клітину, синтезується не тільки його білок, але і GFP. Освітлення клітин майже ультрафіолетовим світлом змушує їх флуоресцентувати яскраво-зелений колір. Таким чином експериментатор може бачити, коли і де ген експресується в живому організмі.

ДНК-чіпи

Всі описані до сих пір методи обмежуються моніторингом експресії одного або, максимум, декількох генів. Але коли умови змінюються в клітині, транскрипція і переклад буквально сотень генів можуть бути змінені.

Завдяки шлюбу

технологія напівпровідникових чіпів
автоматизований синтез олігодезоксинуклеотидів
автоматизовані флуоресцентні сканери
комп'ютерне програмне забезпечення,

тепер можна відстежувати активність буквально тисяч генів в одному виді клітини. Для прикладів:

клітини ссавців при їх перенесенні з «мінімального» середовища культури в одну збагачену факторами росту;
скелетні м'язи мишей у міру їх старіння.

Чіп

Вивчити опубліковані послідовності генів.
Для кожного гена виділіть ~ 20 різних ділянок ~ 25 нуклеотидів, які здаються характерними для цього гена.
Синтезують відповідні їм олігодезоксинуклеотиди.
Також синтезують олігодезоксинуклеотиди для кожного з перерахованих вище, які мають один нуклеотид змінений (зазвичай близько середини). Вони забезпечать контроль.
Використовуючи роботизовані машини для виготовлення чіпів, помічайте ці олігонуклеотиди окремо в масивах, кожна пляма отримуючи мільйони копій, які фіксуються на поверхні чіпа.

З частковим завершенням проекту генома людини три компанії зараз продають чіпи ДНК, що містять від 36 000 до 50 000 штук ДНК, які, як вважають, представляють різні гени людини.

Аналіз

Збирайте свої клітини. Імовірно, вони експресують характерну підмножину своїх генів; тобто транскрибують їх у молекули месенджерної РНК (мРНК).
Витягніть РНК.
Зробіть комплементарну ДНК (кДНК), обробляючи суміш РНК зворотною транскриптазою.
Транскрибуйте кДНК назад у тепер сильно посилену РНК.
Прикріпіть флуоресцентні мітки до РНК.
Залити чіп цією сумішшю.
РНК, які знаходять свої додаткові послідовності на мікросхемі, зв'язуватимуться з ними. (Вони будуть менш сильно зв'язуватися з сусідніми плямами зі зміною одного нуклеотиду, якщо зв'язування дійсно специфічне.
Підсвічуємо чіп і автоматично записуємо інтенсивність кольору на кожній плямі.
Використовуйте комп'ютер для аналізу шаблону.

Результати моніторингу широкогеномної експресії

Про цю роботу повідомили В.Р. Айєр та ін. У 1 січня 1999 року випуску Науки. Він включав моніторинг експресії 8613 різних генів.
Миші, вирощені на обмеженій дієті, не демонстрували таких різких зрушень у експресії генів, як вони старіли. Це добре поєднується з даними про те, що миші на обмежених дієтах старіють повільніше, ніж ті, хто перебуває на багатих дієтах.