9.11: Експресія генів, специфічних для клітин
- Page ID
- 5667
![альт](https://bio.libretexts.org/@api/deki/files/6606/InghamFtz016.jpg)
Приклад: Зробити дрозофілу трансгенною для рекомбінантної ДНК, що містить:
- ген Z для бета-галактозидази
- парно-пропущений (напередодні), (інший ген гомеобкса).
Будь-яка клітина з факторами транскрипції для включення рівномірно пропущеного промотора почне робити бета-галактозидазу. З огляду на належний субстрат, фермент виробляє кольоровий продукт.
Наведена вище фотографія показує 7 смуг цього кольорового продукту, що ідентифікують клітини, які експресували навіть пропущений ген. Про цю подію «повідомив» ген LaCZ. Темні смуги 7 розкривають області, які чергуються з 7 смугами, утвореними клітинами, що виражають фуші-тарасу.
Зелений флуоресцентний білок (GFP)
У природі зелений флуоресцентний білок (GFP) виробляється, Aequorea victoria, тихоокеанська північно-західна медуза. Білок став представляти великий інтерес для клітинних і молекулярних біологів, оскільки він може виявити експресію генів в живих клітині.
Це робиться шляхом злиття гена для GFP з геном, експресія якого вас цікавить. Коли цей ген включається в клітину, синтезується не тільки його білок, але і GFP. Освітлення клітин майже ультрафіолетовим світлом змушує їх флуоресцентувати яскраво-зелений колір. Таким чином експериментатор може бачити, коли і де ген експресується в живому організмі.
ДНК-чіпи
Всі описані до сих пір методи обмежуються моніторингом експресії одного або, максимум, декількох генів. Але коли умови змінюються в клітині, транскрипція і переклад буквально сотень генів можуть бути змінені.
Завдяки шлюбу
- технологія напівпровідникових чіпів
- автоматизований синтез олігодезоксинуклеотидів
- автоматизовані флуоресцентні сканери
- комп'ютерне програмне забезпечення,
тепер можна відстежувати активність буквально тисяч генів в одному виді клітини. Для прикладів:
- клітини ссавців при їх перенесенні з «мінімального» середовища культури в одну збагачену факторами росту;
- скелетні м'язи мишей у міру їх старіння.
Чіп
![альт](https://bio.libretexts.org/@api/deki/files/6608/DNAchip.gif)
- Вивчити опубліковані послідовності генів.
- Для кожного гена виділіть ~ 20 різних ділянок ~ 25 нуклеотидів, які здаються характерними для цього гена.
- Синтезують відповідні їм олігодезоксинуклеотиди.
- Також синтезують олігодезоксинуклеотиди для кожного з перерахованих вище, які мають один нуклеотид змінений (зазвичай близько середини). Вони забезпечать контроль.
- Використовуючи роботизовані машини для виготовлення чіпів, помічайте ці олігонуклеотиди окремо в масивах, кожна пляма отримуючи мільйони копій, які фіксуються на поверхні чіпа.
З частковим завершенням проекту генома людини три компанії зараз продають чіпи ДНК, що містять від 36 000 до 50 000 штук ДНК, які, як вважають, представляють різні гени людини.
Аналіз
- Збирайте свої клітини. Імовірно, вони експресують характерну підмножину своїх генів; тобто транскрибують їх у молекули месенджерної РНК (мРНК).
- Витягніть РНК.
- Зробіть комплементарну ДНК (кДНК), обробляючи суміш РНК зворотною транскриптазою.
- Транскрибуйте кДНК назад у тепер сильно посилену РНК.
- Прикріпіть флуоресцентні мітки до РНК.
- Залити чіп цією сумішшю.
- РНК, які знаходять свої додаткові послідовності на мікросхемі, зв'язуватимуться з ними. (Вони будуть менш сильно зв'язуватися з сусідніми плямами зі зміною одного нуклеотиду, якщо зв'язування дійсно специфічне.
- Підсвічуємо чіп і автоматично записуємо інтенсивність кольору на кожній плямі.
- Використовуйте комп'ютер для аналізу шаблону.
Результати моніторингу широкогеномної експресії
- Про цю роботу повідомили В.Р. Айєр та ін. У 1 січня 1999 року випуску Науки. Він включав моніторинг експресії 8613 різних генів.
- Миші, вирощені на обмеженій дієті, не демонстрували таких різких зрушень у експресії генів, як вони старіли. Це добре поєднується з даними про те, що миші на обмежених дієтах старіють повільніше, ніж ті, хто перебуває на багатих дієтах.