9: Методи
- Page ID
- 4711
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
Середовище клітини дуже складне, що робить її дуже складною, якщо не неможливою, вивчати окремі реакції, ферменти або шляхи всередині неї. З цієї причини біохіміки вважають за краще ізолювати молекули (ферменти, ДНК, РНК та інші цікаві молекули), щоб їх можна було аналізувати без втручання мільйонів інших процесів, що відбуваються одночасно в клітині. Багато методів, що використовуються при виділенні молекул з клітин, передбачають певну форму хроматографії. Щоб відокремити сполуки від їх клітинних середовищ, потрібно спочатку розбити (лізувати) клітини. У цьому розділі ми опишемо деякі методи, які біохіміки використовують для виконання своєї роботи.
- 9.1: Порушення клітин
- Існує кілька способів розбиття відкритих клітин. Який би метод не використовувався, отримані сирі лізати містять всі молекули в клітині, і, отже, повинні бути додатково оброблені, щоб розділити молекули на менші підмножини або фракції.
- 9.2: Фракціонування
- Фракціонування зразків зазвичай починається з центрифугування. За допомогою центрифуги можна видалити і залишки клітин, і фракціонувати органели, і цитоплазму. Наприклад, ядра, будучи відносно великими, можуть закручуватися на досить низьких швидкостях. Після осадження ядер залишився розчин або супернатант можна центрифугувати з більшими швидкостями для отримання менших органел, таких як мітохондрії. Кожна з цих дробів буде містити підмножину молекул в клітці.
- 9.3: Іонообмінна хроматографія
- При іонообмінної хроматографії опора складається з крихітних кульок, до яких прикріплені хімічні речовини, що володіють зарядом. Кожна заряджена молекула має зустрічний іон.
- 9.4: Гелева виключення хроматографії
- Гелева виключення хроматографія - це метод ізоляції з низькою роздільною здатністю. Це передбачає використання намистин, які мають в них крихітні «тунелі», кожен з яких має точний розмір. Розмір іменується як «межа виключення», що означає, що молекули вище певної молекулярної маси не впишуться в тунелі. Молекули з розмірами, більшими за межу виключення, не потрапляють в тунелі і відносно швидко проходять через колону, пробираючись між намистинами.
- 9.5: Аффінна хроматографія
- Афінна хроматографія використовує спорідненість зв'язування молекул мішеней (як правило, білків) для речовин, ковалентно пов'язаних з кульками. Наприклад, якщо хтось хотів відокремити всі білки у зразку, який зв'язується з АТФ, від білків, які не зв'язують АТФ, можна ковалентно зв'язати АТФ з підтримкою кульок, а потім пропустити зразок через колонку. Всі білки, які зв'язують АТФ, будуть «прилипати» до стовпчика, тоді як ті, які не пов'язують АТФ, швидко пройдуть через нього.
- 9.7: Гістидин позначення
- Гістидин мічення є потужним інструментом для виділення рекомбінантного білка з клітинного лізату. Білок, що виробляється при експресії цього гена, має пробіг залишків гістидину, злитих на карбоксил або амінотермінал з амінокислотами в решті білка. Бічні ланцюги гістидину цього «тега» мають спорідненість до іонів нікелю або кобальту, завдяки чому відділення білків, позначених гістидином, від клітинного лізату порівняно легко.
- 9.8: Електрофорез
- Молекули ДНК довгі і навантажені негативними зарядами, завдяки своїм фосфатним кісткам. Електрофоретичні методи відокремлюють великі молекули, такі як ДНК, РНК та білки, виходячи з їх заряду та розміру. Для ДНК і РНК заряд нуклеїнової кислоти пропорційний її розміру (довжині). Для білків, які не мають рівномірного заряду, застосовується розумний трюк, щоб змусити їх імітувати нуклеїнові кислоти.
- 9.10: Мікромасиви
- Мікромасиви ДНК, наприклад, можуть бути використані для визначення всіх генів, які експресуються в даній тканині, одночасно. Мікромасиви використовують сітку (або масив), зроблену з рядків і стовпців на скляному слайді, причому кожна коробка сітки містить багато копій певної молекули, скажімо, одноланцюгової молекули ДНК, що відповідає послідовності одного унікального гена.