1.6: Суперколінг ДНК та топоізомерази
- Page ID
- 7429
Розмотування спіралі під час реплікації ДНК (під дією спіралі) призводить до супернамотування ДНК перед виделкою реплікації.
- Цей супернамотування збільшується з прогресуванням вилки реплікації.
- Якщо супернамотування не полегшити, це фізично завадить руху спіралі.
Топологію ДНК можна описати трьома параметрами:
- Число зв'язування (L) Ціле значення. «Позитивний» посилається як правша.
- Twist (T) Справжнє число («видиме» число зв'язків)
- Writhe (W) дійсне число («суперкотушки» в структурі ДНК)
Розглянемо замкнуту кругову ДНК:
- Число зв'язування є цілим значенням.
- Це стосується кількості разів, коли дві нитки дуплексу роблять повний поворот на 360 градусів.
Для циркулярно замкнутої ДНК, як геном E. coli, число зв'язування може бути змінено лише в тому випадку, якщо ми зробимо наступне:
- фізично розірвати дуплекс
- ввести (або видалити) поворот на 360 градусів
- лігатувати (ковалентно закрити) розрив.
.png)
Малюнок 1.6.1: Повороти для зміни номера зв'язування
Експеримент з гумової трубки «спіраль»
Виріжте дві довжини 1/8 «гумових труб, кожна довжиною близько 20». Вставте менший шматок трубки або шматок наконечника піпетки в кінці, щоб кінці були з'єднані. Ці два шматки гумових трубок представляють кожну нитку дуплексу ДНК. ДНК може бути перев'язана або приєднана, коли у нас є 5' (фосфат) і 3' (гідроксил) кінці. Тому нам потрібен спосіб відстежувати, який кінець, який для кожного шматка трубки.
- Ви можете або написати «5» і «3» на протилежних кінцях кожного шматка і вирівняти їх в протилежних напрямках, або
- На одному шматку тюбінга відзначте обидва кінці за допомогою шарпі. Лише аналогічно кольорові кінці можна перев'язати (див. Схему вище)
Це дозволить зберегти правильну «орієнтацію» пасом, коли ви «лігуєте» пасма дублянки.
- Введіть номер зв'язку = +2 (два повороти правою рукою на 360° в дуплекс)
- потім «лігіруйте» кінці (переконайтеся, що ви зберігаєте орієнтацію пасом, тобто ви з'єднуєте відповідні дві пасма).
Переконайтеся, що правильне число зв'язування було введено шляхом «плавлення» дуплексу з одного боку і змушуючи все перетворюватися в невелику область дуплексу (легко порахувати таким чином).
- Підтвердіть, що дивлячись вниз по спіралі на поворотах, що вони «правші» (неважливо, в який бік ви дивитеся вниз по спіралі).
Зверніть увагу, що «дуплекс», коли утримується між великим і вказівним пальцями і дозволений повісити, віддає перевагу «суперспіральної» топології, на відміну від «розслабленої» [Примітка: це зазвичай спостерігається з дуже худими трубками, трубки більшого діаметру можуть не легко прийняти цю топологію].
- Переконайтеся, що «суперкотушки» насправді ліворуч, коли ви дивитеся вниз суперкотушки (незалежно від напрямку вниз по суперкотушках).
- «Суперкотушка», швидше за все, повний 360°, а не 180°. У будь-якому випадку тримайте кінці дуплексу так, щоб була присутня «суперкотушка» лівої руки 360°.
- Тепер порахуйте, скільки разів пасма «дублянки» перетинають один одного. У цій конформації пасма «дуплексу» фактично не перетинаються один одного (Примітка: у вас може бути перетин одного пасма, а потім розхрещення, для чистого результату відсутності перетину).
Таким чином, у відповідь на введення +2 зв'язувального числа, «дуплекс» може прийняти +2 (180°) «суперкотушки», таким чином, що результуючий видимий номер зв'язку (тобто значення «скручування») двох ниток дорівнює нулю
Примітка
Суперкотушка вважається позитивною, якщо вона «лівша»).
- Видаліть одну «позитивну» суперкотушку, розмотувавши на 180°.
- Тепер утримуйте кінці «дуплексу» і порахуйте видиме число зв'язків (тобто "повороти «). З'явиться одиночна правша «твіст».
- Таким чином, одна 180° «позитивна» суперкотушка має ефект видалення одного «позитивного» скручування (тобто зменшує видиме число зчеплення на 1).
Число Writhe відноситься до кількості присутніх суперкотушок.
- Хоча може здатися, що наслідком введення супернамотування (Writhe) є зміна номера Linking, це не так.
- Наслідком Writhe є те, що Twist (видиме число зв'язків) змінюється (збільшується або зменшується).
ДНК має бажане значення «Twist» (бажаний видимий номер зв'язку) для певної довжини ДНК:
- Модель дуплексу ДНК Уотсона та Крика мала 10 базових пар за хід.
- У фізіологічних умовах солі (0,15 М NaCl) і температури ДНК воліє приймати близько 10,6 bp/чергу.
- Writhe вводиться в ДНК для досягнення цього значення для «Twist» (видимий номер зв'язку)
Для даного (фіксованого) числа зв'язків над заданою довжиною ДНК ДНК може приймати або позитивні, або негативні суперкотушки для досягнення «повороту» (видимого числа зв'язків) таким чином, що буде 10,6 базових пар/поворот.
Номер зчеплення не змінюється при супернамотуванні (воно може змінюватися лише порушенням дуплексу)
- Writhe має ефект зміни видимого номера зв'язку.
- Одна суперкотушка визначається як можливість змінити видимий номер зв'язку на +/- 1.
Значення скручування (видиме число зв'язків) для заданої довжини ДНК пов'язане з кількістю пар основ за хід, які ДНК хоче прийняти:
Номер зв'язку = (розмір ДНК в парах основ)/(базові пара/поворот) + Writhe
або
Номер зв'язку = #of Скрутки + Написати
це зазвичай скорочено як
Зв'язка = Твіст + Написати
Л = Т + Ш
Наприклад, якщо у нас є циркулярно замкнута молекула ДНК довжиною 5300 пар основ та кращу конформацію 10,6 базових пар за хід, чи може вона досягти цієї конформації без необхідності введення будь-якої супернамотки (тобто writhe)?
Очевидне число зчеплення (Twist) = (5300 базових пар)/(10,6 базових пар/поворот)
Очевидне число зчеплення (Twist) = 500
Іншими словами, для досягнення бажаної конформації 10,6 уд/оборот в спіралі потрібно рівно 500 витків на довжину 5300 пар основи.
Кількість зв'язків = 500 + Написати
Ми можемо мати інтегральні значення для числа зв'язків, і ми можемо, звичайно, ввести 500, що не вимагало б Writhe взагалі:
500 = 500 + 0
Яка молекула ДНК склала 5200 пар основ?
Очевидне число зчеплення (Twist) = (5200 базових пар)/(10,6 базових пар/поворот)
Очевидне число зв'язків (Twist) = 490,6
Ми можемо ввести або 490, або 491 як номер зв'язку, але не 490,6. Що станеться, якщо в молекулі ДНК є номер зв'язку 490?
Номер зв'язку = Твіст + Написати
490 = 490.6 + Записати
Написати = -0.6
У цьому випадку ДНК приймає негативну 0.6 суперкотушку (близько 108° правосторонньої суперкотушки), що збільшить видиме число зв'язків з 490 до 490,6 (і досягне 10,6 базових пар за оборот в дуплексі).
Скільки базових пар за хід було б в ДНК, якби ДНК не змогла прийняти жодної структури суперкотушки для такої довжини ДНК з номером зв'язку 490?
Номер зв'язку = Твіст + Написати
490 = Твіст + 0
Твіст = 490 оборотів
Твіст = (5200 базових пар)/(біт/поворот) = 490 обертів
біт/поворот = 5200 базових пар/490 обертів
біт/оборот = 10,61
У ДНК є трохи більше 10,6 базових пар на хід.
Малий циркулярно замкнутий геном
Геном вірусу Simian 40 (SV40) - це круговий, закритий, дволанцюговий ДНК геном. Для цілей цієї дискусії він має 5300 баз. Ми очікуємо, що в фізіологічних умовах ДНК буде демонструвати 10,6 пар основ за хід (тобто один Twist = 10.6 bp/оборот). У цьому випадку, без Writhe, номер посилання буде:
Номер зв'язування = 5300 бп/ (10,6 біт/поворот) + 0
Кількість посилань = 500 оборотів
тобто ми очікуємо 500 поворотів на 360° ниток ДНК по довжині кругового генома.
- Ця форма (з 10,6 пар основи на хід) без Writhe представляє «стандартну» або неспотворену спіраль ДНК.
- Це також відоме як «розслаблена» форма ДНК, і дуплекс фізично може бути викладено рівно на поверхні, оскільки йому не потрібно Writhe для досягнення бажаного значення 10,6 базових пар на твіст:
.png)
Малюнок 1.6.2: Стандартна спіраль ДНК
Однак, коли реплікація SV40 спочатку завершена, спостерігається, що в ДНК залишається відкрита дуплексна область:
.png)
Малюнок 1.6.3: ДНК з відкритою областю
Результатом є те, що всередині дуплексної ДНК є близько 475 витків спіралі (тобто число зв'язування = 475).
- Кажуть, що ДНК підмотана.
- Відкрита територія енергетично несприятлива.
- Ковалентно замкнута молекула не може підлаштуватися для цього, збільшивши число Linking. Тобто він не може спонтанно зламати одну або обидві нитки дуплексу, ввести ще 25 витків в дуплекс (збільшити число Linking на 25) і повторно лігувати дуплекс.
ДНК має три варіанти:
- Він може регулювати кількість базових пар за оборот по всій молекулі від бажаних 10,6 біт/поворот до 11,2 біт/оборот (тобто 5300 біт/475 оборотів). (ПРИМІТКА: збільшення кількості базових пар за хід зменшить значення скручування; підмотане ДНК має більшу кількість базових пар за хід).
- ДНК може згорнутися в топологію «суперкотушки» і підтримувати бажане значення скручування (10,6) з заданим номером зв'язку (475 в даному випадку).
- Дуплекс може існувати з скручуванням 10,6 уд/оборот для більшої частини конструкції, а потім мати область з нульовим скручуванням (не обов'язково розплавлений дуплекс). Це досить несприятливо через геометрії, необхідної для склеювання кутів.
Таким чином, для генома 5300 б.п. SV40, з номером зв'язування 475, для підтримки значення 10,6 bp/скручування, в цілому потрібно 25 негативних суперкотушок (Writhe=25):
475 = (5300/10.6) + Написати
-25 = Написати
- Тобто 25 негативних суперкотушок (двадцять п'ять поворотів дуплексу ДНК на 180°, праворуч, коли ви дивитеся вниз суперкотушки).
топоізомерази
Ферменти, які контролюють топологію ДНК, мають вирішальне значення для реплікації та транскрипції ДНК.
- Коли вилка реплікації відкривається, область дуплексу перед виделкою стає перекрученою - тобто вона має менше базових пар на оборот.
- Число зв'язування не змінилося, але довжина ДНК, яка містить всі обороти, фактично коротша.
- Щоб підтримувати 10,6 біт/поворот у цій області, ДНК прийме позитивні суперкотушки.
Наприклад, на ранніх стадіях реплікації SV40 дуплекс навколо походження реплікації може спочатку розплавити (відкрити) область з 750 основ. Оскільки число зв'язку (500) не змінюється, воно ефективно розподіляється лише на:
5300 - 750 = 4550 підстав.
Припускаючи, що супернамотування не було введено:
500 = 4550 базових пар/(Х основи/твіст) + 0
= 9.1 базових пара/твіст
Таким чином, якщо не буде введено супернамотування, ДНК повинна прийняти конформацію 9.01 пар основи/скручування спіралі в області перед виделкою реплікації.
- Це енергетично несприятливо, і одним з варіантів ДНК є прийняття суперспіральної конфігурації для досягнення 10,6 bp/скручування:
500 = (4550/10.6) + Написати
70.8 = Записати
- Таким чином, рух зростаючої вилки змушує ДНК приймати позитивні суперкотушки.
- У цьому випадку ДНК прийняла 70,8 лівих суперкотушок (180° кожна).
- Twist (= basepari* [скручування/базова пара]) і Writhe є дійсними числами.
Топоізомераза I типу
- Топоізомерази I типу розрізають одну нитку ДНК (тобто вона «зарізає» дуплекс ДНК).
- 5' фосфат нікерованої пасма ковалентно прикріплений до тирозину в білку.
- 3' кінець псевдоніма потім проходить один раз через дуплекс.
- Потім псевдонім повторно герметизується, а число зв'язків змінюється на значення +1.
- Таким чином, це може призвести до видалення однієї негативної суперкотушки.
У кишковій паличці топоізомераза I типу може полегшити лише негативну суперколінгу ДНК (негативний суперколінг є кінцевим результатом знову реплікованого генома ДНК). У еукаріотів топоізомераза I типу також може полегшити позитивно суперспійновану ДНК.
Чистий результат E. coli ToPoI можна намалювати наступним чином:
.png)
Малюнок 1.6.4: Топоізомераза кишкової палички I
Топоізомерази II типу
- Топоізомерази II типу фактично розщеплюють дуплексну ДНК при зміні числа зв'язків.
- Топоізомерази II типу можуть перетворити одну позитивну суперкотушку в негативну суперкотушку.
- Таким чином, число зчеплення зменшується на два (-2) за один крок.
- Топоізомерази II типу беруть участь як в декатенації дочірніх хромосом, так і в полегшенні позитивного суперколінгу перед виделкою реплікації.
- ДНК-гіраза E. coli є прикладом топоізомерази II типу.
.png)
Малюнок 1.6.5: Активність ізомерази II типу