1.5: Реплікація ДНК - Вступ до реплікації прокаріотів

1953

• Модель ДНК Уотсона і Крика запропонувала, як генетична інформація може бути реплікована: будь-яка нитка дуплексу може бути використана як шаблон для реплікації інформації про послідовність.
• Але, була реплікація консервативним (тобто оригінальні батьківські пасма залишаються разом після реплікації) або напівконсервативним (одна батьківська нитка пар з однією новосинтезованою ниткою)?

Відповідь на прокаріотичні організми (тобто відсутність справжнього мембранного зв'язаного ядра та клітинних органел; наприклад, бактерії) прийшла з експерименту 1958 року Месельсона та Шталя.

1958

Азот в солей амонію в культуральному бульйоні включений в основу ДНК. Найбільш поширеним ізотопом азоту є ¹⁴ Н. Однак можна отримати і ¹⁵ N амонійних солей (більш важкий ізотоп).

• ДНК з клітин E. coli, вирощених з ¹⁵ N солями амонію, матиме більшу щільність, ніж ДНК, вирощена в «нормальних» (¹⁴ N) солей амонію.
• Така ДНК буде по-різному мігрувати на центрифугування градієнта рівноважної щільності хлориду цезію (CScL ₂).
• Більш щільна ДНК буде мігрувати як нижня смуга (на цьому типі центрифугування характерне положення міграції є функцією щільності і не залежить від довжини ДНК).

Малюнок 1.5.1: Щільність ¹⁵ N і ¹⁴ N ДНК

Месельсон і Шталь міркували, що якщо вони виростили кишкову паличку в ¹⁵ N солей, потім перейшли середовища на ¹⁴ N солей для додаткових раундів реплікації, то режим реплікації можна було б вивести з щільності ДНК.

Малюнок 1.5.2: Експеримент Месельсона і Шталя

• Після переходу на ^{середовище 14} N і дозволу клітинам пройти цикл реплікації спостерігалася одна смуга проміжної щільності (тобто між ¹⁴ N і ¹⁵ N контрольними зразками ДНК).
• Після другого раунду реплікації в середовищах ¹⁴ N дві смуги були присутні приблизно в еквівалентних кількостях; одна була проміжною за щільністю, а інша мігрувала як чисто ¹⁴ N мічена ДНК.

Результати відповідали напівконсервативному способу реплікації ДНК. Докази напівконсервативної реплікації ДНК з тих пір були отримані як з ДНК рослин, так і тварин.

Реплікація ДНК у кишкової палички

Е. coli ДНК-полімеразні характеристики:

• Полімераза лише подовжить існуючий полінуклеотид. Він не може ініціювати утворення полінуклеотидів:

Малюнок 1.5.3: ДНК-полімеразна активність

• Полімераза буде каталізувати полімеризацію нуклеотидів тільки в одному напрямку (5'>3') через фосфодіефірний зв'язок між 3' гідроксильною та 5' фосфатною групою.
• ДНК-полімераза не в змозі розмотати дуплексну ДНК, щоб відокремити дві нитки, які потрібно скопіювати.

Геном кишкової палички - це кругова дуплексна ДНК приблизно 4 х 10 ⁶ пар основ (тобто 4 Мб)

• Геном має єдине походження реплікації.
• Дублювання ДНК у кишкової палички починається на певному місці в ДНК під назвою «OriC».

ORIC - це область ДНК довжиною приблизно 240 нуклеотидів.

• Він містить повторювані 9-базові пари та 13-базові парні послідовності (відомі як «9-мерні» та «13-мерні» області).
• Ці послідовності є багатими на AT регіонами, які плавляться при більш низьких температурах, ніж ДНК, що містить пари ГК.
• Ці регіони постулюються, щоб допомогти розплавити дуплекс ДНК в OriC області для ініціації реплікації ДНК.

Малюнок 1.5.4: OriC область

Продукт гена DNaA: (білок DNaA)

• Штами кишкової палички з мутаціями в гені ДНКА змогли рости при 30 °С, але не при 39-42 °С.
• Однак, якщо синтез ДНК розпочався при 30° C, а потім температура була зрушена до 42° C, синтез ДНК продовжувався до тих пір, поки геном не був реплікований (і клітина розділена), але нова ініціація синтезу ДНК не була можлива.

Висновок: Якимось чином продукт гена dNaA (тобто білок ДНК) необхідний для ініціації синтезу ДНК.

Дослідження очищеного білка DNaA:

• Білок DNaA зв'язується з «9-мерною» областю в oRiC і утворює мультимерний комплекс з 10-20 білковими субодиницями (тобто в одній ORiC-області буде зв'язано 10-20 молекул білка dNaA).
• Прив'язка вимагає АТФ.
• Подальше додавання АТФ спостерігалося, що призвело до плавлення та відкриття дуплексу ДНК в OriC області. Це було визначено додаванням нуклеази S1 (як маш, але також виріже ДНК на місці внутрішнього ніка), що призвело до розщеплення ДНК на місці OriC.

Продукт гена DnAb: (білок DnAb)

Білок, закодований геном dNaB, здається, має важливе значення для реплікації ДНК. Білок DnAb був ідентифікований як helicase. Хеліказа рухається вздовж ланцюга ДНК, відкриваючи дуплекс, щоб розплавити та відокремити нитки ДНК.

• Білок DnAb зв'язується з одноцепочечной ДНК в загальній області сегмента OriC ДНК.
• Зв'язування вимагає АТФ, а також генного продукту dNaC (білка DNaC).
• Після того, як Helicase/DNaC зв'язується з ДНК, вивільняється білок dNaC.
• Дві спіралі зв'язуються в OriC області, по одній спіралі на кожній нитці ДНК.

Цей етап являє собою комплекс препраймінга:

Малюнок 1.5.5: Комплекс прегрунтування

Відокремлені нитки в області OriC запобігають повторному відпалу шляхом зв'язування однониткового зв'язуючого білка (білка ssb).

Білок гена DNaG:

Білок гена DNaG називається примазою.

• Примаза каталізує синтез коротких молекул РНК, які функціонують як праймери для синтезу ДНК E. coli ДНК-полімеразою III (пол III).
• Примаза зв'язується з білком DnAb при ORiC і утворює примосому.
• Примаза в складі комплексу примосом забезпечує РНК-праймери для синтезу обох ниток дуплексної ДНК.
• Примаза відкладає сліди PPPac (N) _7-10 (РНК).

Малюнок 1.5.6: Діяльність примази

• Після синтезу грунтовки 9-12 мер РНК, голофермент ДНК Пол III потрапляє у вилку реплікації і здатний використовувати РНК як праймер для синтезу ДНК.
• У міру розкриття вилки реплікації синтез провідного пасма може тривати, але в відстаючої пасма розвивається розрив:

Малюнок 1.5.7: Відстаюча пасмо

ДНК Пол III - це великий мультикомплексний фермент (холоензим), який має кілька димерний характер (є два полімеразних активних ділянки). Два активних полімеразних ділянки в Pol III можуть фактично функціонувати для синтезу обох нацентних ниток на розвилці. Однак синтез відстаючої шаблонної нитки був би в протилежному напрямку руху комплексу Пол III:

Малюнок 1.5.8: Рух Пол III

Примаза може зв'язуватися з комплексом Пол III, але розташування нитки ДНК при її проходженні через комплекс Pol III/Primase досить унікальне. Він утворює структуру петлі, таку, що примаза і активний сайт Pol III можуть здійснювати переривчастий синтез відстаючої шаблонної нитки, хоча загальний напрямок комплексу Пол III протилежний необхідному напрямку синтезу ДНК:

Малюнок 1.5.9: Петля для активності Пол III

Після того, як primase робить ще один праймер на відстаючий шаблон, суміжний Pol III активний сайт може розширити грунтовку (включаючи dNTp), використовуючи ту ж структуру петлі та подаючи шаблон через у напрямку, показаному.

Малюнок 1.5.10: Синтез відстає пасма

Відстаюча петля нитки не може бути продана через комплекс Pol III назавжди, а після синтезу зароджується нитка ДНК петля звільняється і формується нова з використанням розкритої шаблонної ДНК далі по виделці:

Малюнок 1.5.11: Продовження синтезу відстаючих пасом

Як синтез триває:

• на провідній нитці буде одна безперервна нитка ДНК
• на відстаючої пасма буде ряд коротких фрагментів, що містять і РНК, і ДНК, звані фрагментами Окадзакі:

Малюнок 1.5.12: Фрагменти Окадзакі

Як ці фрагменти РНК/ДНК перетворюються в одну довгу безперервну нитку ДНК? РНК може бути видалена полімеразою, яка має 5'->3' екзонуклеазну активність, однак Пол III не вистачає цієї активності.

• ДНК Пол I має 5'->3' активність екзонуклеази
• він може розширити синтез ДНК за допомогою нік-трансляції.
• Активність нік-трансляції призводить до деградації праймерів РНК.
• Кінцевим результатом є серія «уколів» в відстаючої пасма, тепер 100% ДНК:

Малюнок 1.5.13: Закоси в відстає пасмо

• ДНК Пол I залишає і ДНК лігази потім приєднується до цих розривних фрагментів ДНК, щоб сформувати безперервний дуплекс ДНК на відстаючої нитку.

Короткий зміст етапів синтезу ДНК кишкової палички

1. Білок ДНК плавиться дуплексно в OriC області.
2. DnAb (helicase) разом з DNaC і АТФ зв'язується з виделкою реплікації (білок DNaC виходить). ¹ (Комплекс попереднього грунтування)
3. Одножильний зв'язуючий білок (білок ssb) зв'язується з відокремленими нитками ДНК і запобігає повторному відпалу.
4. Комплекси примази з хеліказом, створює РНК-праймери (PPPac (N) _7-10) на нитках відкритого дуплексу ² (Primase+Helicase складають Прімосому).
5. Після виготовлення праймерів РНК, голоензим ДНК pol III надходить і розширює праймер РНК (укладаючи dNTP) на провідну нитку.
6. Як реплікації вилка відкривається вгору (за допомогою helicase+ATP дії) синтез провідної нитки є безперервним процесом, відстаюча нитка відчуває розрив.
7. Область розриву відстаючої пасма може намотуватися навколо однієї активної ділянки комплексу Pol III, а зв'язана Primase ініціює праймер РНК в області щілини ³.
8. На відстаючої пасма Пол III подовжує праймер РНК з DNTP, оскільки відстаюча шаблонна нитка петельно проходить через комплекс Pol III.
9. Після синтезу зароджується фрагмента відстаюча петля пасма звільняється, а область однієї нитки далі вгору біля вилки реплікації згодом петельно проходить через комплекс Пол III.
10. Кроки 7-9 повторюються.
11. Тим часом Пол I видаляє райони праймера РНК фрагментів Окадзакі через активність екзонуклеази від 5 до 3' (переклад нік)
12. Пол I виходить і лігазує суглоби фрагменти ДНК (на відстаючу пасмо).

Нотатки зверху

1. Полімерази не в змозі відкрити дуплексну ДНК, таким чином, вимога до гелікази
2. Полімерази не можуть реплікувати шаблон ДНК за відсутності праймера (або ДНК, або РНК).
3. Полімерази розширюють полінуклеотид лише у напрямку від 5 до 3'. Прогалини на кінці 5' повинні бути заповнені «вгору за течією» переривчастий синтез.

Властивості полімераз кишкової палички (Пол I, II і III)

	ДНК Пол I	ДНК Пол II	ДНК Пол III
5'->3' активність полімерази	*	*	*
3 '-> 5' активність екзонуклеази (доказ читання)	*	*	*
5'->3' активність екзонуклеази (переклад псевдоніма)	*
Синтез з:
Дуплексна ДНК
Загрунтована одна нитка	*
Загрунтована одна нитка плюс SSB білок	*		*
Швидкість подовження ланцюга (in vitro) б/хв	600	?	30 000
Молекули/клітина	400	?	10-20
Смертельна мутація?	*		*

Функції POL:

• Пол I: заповнення прогалин при синтезі та репарації ДНК, видалення праймерів РНК
• Пол II: бере участь у синтезі ДНК пошкоджених шаблонів
• Пол III: функціональна полімераза на вилці реплікації

Пол III Структура і функції

• «Голоензимний» комплекс з 10 різних поліпептидів
• результуюча молекулярна маса більше 600 кДа (тобто це великий комплекс).
• Структурно це асиметричний димер - він містить дві копії більшості поліпептидів, які його складають, включаючи два каталітичні ділянки для нуклеотидного додавання (тобто полімеризації).

Різні білкові субодиниці мають різноманітні функції:

1. Субодиниці полімеразної активності: a, e, субодиниці
2. Субодиниці для димеризації основної полімерази (t)
3. Субодиниці для підвищення технологічності (тобто для збільшення здатності синтезувати довгі розтяжки без вивільнення з шаблону ДНК): b субодиниць
4. Субодиниці для зв'язування b з ДНК-грунтовкою підкладки: (g, d, d ', c,)

Припинення реплікації ДНК

• Специфічні місця припинення реплікації ДНК існують у кишкової палички.
• Припинення передбачає зв'язування продукту гена tus (білка tus).
• Цей білок може діяти, щоб запобігти розмотуванню ДНК гелікази (отже, зупинить дію pol III та pol I).
• Реплікація ДНК виробляє два переплетених кільця, які повинні бути розділені.
• Це досягається за допомогою ферменту топоізомерази.

Плазміда Cole1

Кишкова паличка може містити невеликий екстрахромосомний елемент, званий плазмідою Cole1. Ця плазміда має такі загальні риси:

• 6,4 Кб кругової дуплексної ДНК
• Автономне тиражування
• 10-15 копій на клітину (тобто на хромосому кишкової палички)

Незважаючи на те, що він автономно реплікується, він не містить послідовності orIC типу для ініціації реплікації і не проходить однакових етапів у реплікації.

• Плазміда виробляє (серед іншого) два олігонуклеотиди РНК (РНК I та РНК II)
• РНК II має взаємодоповнюваність до походження реплікації Cole1, яка містить багату послідовність AT
• Зв'язана молекула РНК II може служити праймером для PoliII
• Оскільки РНК II зв'язується лише на одній нитці, реплікація плазміди ColE1 є односпрямованою.
• РНК I має комплементарність з РНК, і така дуплексна РНК не може служити праймером реплікації, таким чином контроль числа плазмідної копії досягається взаємодією між РНК I і РНК II.