1.5: Мікроскопія

Цілі навчання

Цілі:

• Правильно використовувати і доглядати за чутливим науковим інструментом.
• Вивчіть методи, необхідні для підготовки клітин до перегляду за допомогою мікроскопа.
• Отримати відчуття розміру осередків.

Результати навчання студентів:

Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

• Визначте частини мікроскопа і їх функції.
• Правильно носити, використовувати і зберігати мікроскоп.
• Підготуйте гірку для мокрого кріплення.
• Переглядайте та фокусуйте зразки під мікроскопом.
• Визначте повне збільшення зразка.
• Знайдіть зразок, якщо йому надається слайд.

Вступ

У біології складний світловий мікроскоп є корисним інструментом для вивчення невеликих зразків, які не видно неозброєним оком. Мікроскоп використовує яскраве світло для освітлення через зразок і забезпечує перевернуте зображення з великим збільшенням і роздільною здатністю. Є дві лінзи, які збільшують зображення зразка - об'єктив на носі і очна лінза (або окуляр). Щоб визначити загальне збільшення зразка, необхідно помножити збільшення об'єктива на збільшення очної лінзи.

Вчені і техніки часто використовують світлові мікроскопи для вивчення клітин. Прокаріотичні клітини дуже прості і не мають ядра або мембрани зв'язаних органел і мають невеликі розміри. З іншого боку, еукаріотичні клітини складніші тим, що містять ядро і багато спеціалізованих органел. Структура клітини диктує її функцію; таким чином, кожна еукаріотична клітина виглядає дуже відрізняється від наступної. Ось чому серцева клітина виглядає зовсім не так, як нейрон (клітина мозку).

Дуже важливо навчитися правильно поводитися з мікроскопом і користуватися ним. Перегляньте наступні правила та поради щодо використання та поводження з мікроскопом.

Малюнок 1. Марковані частини мікроскопа.

Загальні правила

• Завжди ПОЧИНАЙТЕ та ЗАКІНЧУЙТЕ лінзою низької потужності при надяганні АБО забираючи слайд.
• Ніколи не повертайте шматок носа за об'єктив.
• Не отримуйте жодної частини мікроскопа мокрою - особливо сценічні та об'єктивні лінзи.
• Для очищення лінз мікроскопа використовуйте тільки папір для лінз.

Очищення мікроскопа

Якщо потрібно, отримайте невеликий квадрат паперу для лінз (і ТІЛЬКИ папір для лінз) і обережно протріть лінзи мікроскопа безпосередньо поперек, у такому порядку:

1. нижня поверхня всіх об'єктивів
2. очна лінза
3. об'єктив конденсатора і корпус світла

Частина I: Пошук листа

Матеріали

• Мікроскоп
• Папір для об'єктивів
• Літера «Е» слайд
• Етап Мікрометр Slide

Порядок дій

1. Завжди використовуйте одну руку навколо руки мікроскопа і одну руку під основою мікроскопа.
2. Носіть його у вертикальному положенні без розгойдування, перекидання, падіння або натикання мікроскопом.
3. Помістіть мікроскоп обережно на лаві лабораторії рукою до себе. Ніколи не ставте мікроскоп біля краю і ніколи не ковзайте його по столу.

Визначте наступні частини мікроскопа з партнером. Перевірте кожну частину, як ви йдете. Якщо ви не впевнені в компоненті, проконсультуйтеся з інструктором.

• Окуляр (очна лінза)
• Кільце насадки (башточка)
• Об'єктиви (низької, середньої, високої потужності)
• Етап
• Етап управління
• Ірис Мембранний конденсатор об'єкти
• Джерело світла
• Ручка інтенсивності світла (реостат)
• Ручка грубого регулювання фокусу
• Ручка регулювання тонкого фокусування

4. Обережно підключіть і розташуйте електричний шнур, щоб уникнути спрацьовування або витягування мікроскопа зі столу.
5. Увімкніть мікроскоп і поверніть кільце носової частини (башту), щоб зафіксувати 10-кратний об'єктив на місці. Не використовуйте об'єктив для обертання!
6. Поверніть регулятор світла (реостат) наполовину, щоб відрегулювати кількість світла.
7. Загальне збільшення, яке ви спостерігаєте при перегляді через мікроскоп, - це збільшення очної лінзи, помножене на збільшення об'єктива. Заповніть таблицю 5.1, щоб вказати загальне збільшення, досягнуте кожним об'єктивом.

Таблиця 1. Загальне збільшення досягається за допомогою різних цілей лінзи складного світлового мікроскопа

Назва об'єктива	Об'єктивна лінза	Очна лінза	Загальне збільшення

8. Збоку від мікроскопа розташовані дві ручки, одна над іншою. Більша з двох ручок - це ручка грубого регулювання фокусу. Поверніть ручку так, щоб сцена опустилася якомога далі.
9. Очистіть всі лінзи папером для лінз. Ніколи не використовуйте паперові рушники, серветки або сорочку!
10. Отримайте букву «е» слайд від вашого інструктора. Намалюйте «е» в таблиці 5.2, коли ви розглядаєте його очима (не через мікроскоп).

Таблиця 2. Буква «е» розглядається при різному збільшенні за допомогою світлового мікроскопа

Буква «е», як видно...		Креслення
неозброєним оком
100X загальне збільшення
400X загальне збільшення
1000X загальне збільшення
1000X загальне збільшення
В якому напрямку рухається «е» (при погляді в мікроскоп), коли ви рухаєте сцену вправо?

11. Помістіть гірку на сцену і закріпіть її сценічним затискачем.
12. Використовуйте ручку грубого фокусування, щоб перемістити сцену так високо, наскільки вона може йти.
13. Використовуйте ручки регулювання сцени, щоб центрувати «е», щоб світло від джерела світла могло пройти через нього.
14. Переглядаючи очні лінзи, опустіть сцену за допомогою грубої ручки регулювання фокусу, поки «е» не з'явиться в поле зору.
15. Використовуйте регулятор тонкого фокусування, щоб зробити зображення максимально чітким.
16. На цьому етапі є різні коригування, які ви можете зробити для поліпшення якості зображення:
17. Реостат збоку мікроскопа контролює інтенсивність світла. Якщо він занадто яскравий або тьмяний в будь-який час, використовуйте цю ручку для регулювання світла.
18. Конденсатор також буде регулювати інтенсивність світла. Конденсатор збирає і фокусує світло для освітлення зразка. Використовуйте це тільки в тому випадку, якщо реостат не зміг поліпшити ваш імідж. Перемістіть конденсатор ручкою регулювання конденсатора так, щоб він торкався сцени. Повільно опустіть його, щоб поліпшити освітлення на вашому зразку. Зазвичай він повинен бути приблизно на ½ дюйма нижче ступені.
19. Діафрагма райдужної оболонки регулює отвір і контролює кількість світла, що виходить з конденсатора (або освітлює зразок). Ви можете відкривати і закривати цю діафрагму, для більшості цілей вона повинна бути повністю відкритою, але іноді його часткове закриття збільшить контрастність зображення.
20. Намалюйте букву «е» так, як вона з'являється через мікроскоп в таблиці 4-2. Зверніть увагу на зміну орієнтації. Зверніть увагу, що лівий окуляр можна обертати, але очна шкала (відома як сітка) залишається посередині очної лінзи. Зверніть увагу, що правий окуляр можна обертати, щоб переміщати положення покажчика.
21. Рухайте сцену повільно вправо. Зверніть увагу, в якому напрямку рухається «е», коли ви дивитеся через мікроскоп і записуєте в таблиці 4-2.
22. Перемістіть слайд назад вліво, щоб знову відцентрувати «e».
23. Після того, як «е» буде повторно центруватися і фокусуватися, поверніть носову частину на об'єктив 40x і закріпіть його на місце. Використовуйте тонкий фокус, щоб зробити зображення чітким. Тільки при необхідності робіть регулювання світла за допомогою реостата, конденсатора або діафрагми. Намалюйте все, що бачите, через мікроскоп в таблиці 4-2.
24. Після того, як «е» повторно центрується і фокусується, поверніть носову частину на об'єктив 40x і зафіксуйте його на місце. Використовуйте тонкий фокус, щоб зробити зображення чітким (НІКОЛИ не використовуйте грубий фокус при цьому або будь-якому більшому збільшенні, або ви ризикуєте прив'язати слайд або ще гірше, замикаючи об'єктив!!!) Тільки при необхідності робіть будь-які регулювання світла за допомогою реостата, конденсатора або діафрагми. Намалюйте все, що бачите в мікроскопі в таблиці 4-2. Дайте відповідь на питання нижче.
25. Щоб використовувати об'єктив для занурення масла, поверніть носову частину МІЖ лінзами 40x та 100x, щоб паличка, що містить масло, могла дійти до слайда. Помістіть щедру краплю олії на слайд і закріпіть об'єктив об'єктива 100x на місце. Лінза буде ковзати в краплю масла.
26. Використовуйте тонкий фокус, щоб зробити зображення чітким. Тільки при необхідності робіть регулювання світла за допомогою реостата, конденсатора або діафрагми. Намалюйте те, що ви бачите в таблиці 4-2.
27. НІКОЛИ не повертайтеся до об'єктива 40X після того, як на слайді є масло. Якщо у вас виникли проблеми з фокусуванням за допомогою об'єктива для занурення масла, ви повинні повернутися назад і використовувати 10-кратний об'єктив для повторного центрування (поверніть носову частину, щоб об'єктив 40x не перетягувався через масло на слайді). Потім поверніться безпосередньо до 100-кратного об'єктива. Якщо це не спрацює, слайд повинен бути протертий начисто, і ви повинні почати спочатку.

Закінчивши з гіркою, опустіть щабель і зніміть гірку. (Не опускайте сцену, якщо ви збираєтеся переглядати інший слайд). Очистіть масло з гірки і поверніть його інструктору.

Частина II: Діаметр поля

Мікроскопи призначені для збільшення зображень занадто мало, щоб їх було видно неозброєним оком. Однак їх можна використовувати як інструмент для оцінки розмірів об'єкта, що розглядається. Для того щоб це зробити, необхідно знати діаметр кожного поля огляду з кожним об'єктивним об'єктивом. Потім ви можете оцінити, скільки поля займає ваш об'єкт в полі і порівняти це з виміряним діаметром. Наприклад, припустимо, діаметр поля за допомогою лінзи об'єктива 40x становить 0,10 мм. Потім ви переглядаєте об'єкт за допомогою цієї лінзи, яка займає ¼ поля зору. Потім ви можете оцінити, що об'єкт довжиною ¼ (0,10 мм) або 0,025 мм. Щоб визначити діаметр поля, ви будете використовувати сценічний мікрометр слайд, який в основному є дуже тонкою лінійкою (зазвичай 2 мм), яка травлюється на слайді мікроскопа.

Малюнок 2. Етап мікрометр

Порядок дій

1. Отримайте сценічну мікрометричну гірку. БУДЬТЕ ДУЖЕ ОБЕРЕЖНІ. Сценічний мікрометр слайд коштує дорого, тому, будь ласка, ставтеся до нього з повагою! Помістіть слайд мікрометра сцени на сцені і зосередьтеся на міліметровій розмітці за допомогою 10-кратного об'єктива. Запишіть діаметр поля в мм при використанні цієї лінзи в таблиці 3.
2. Перейдіть на 40-кратний об'єктив і фокус. Визначте діаметр поля в мм за допомогою мікрометра і запишіть в таблицю 3. Повторіть ті ж дії для інших об'єктивів.
3. Перетворіть діаметри в мікрометри (мкМ). Всі вимірювання клітин і органел будуть проводитися в мкМ. Ретельно очистіть слайд і покладіть його назад у лоток на демонстраційному столі.

Таблиця 3. Визначення поля зору за допомогою сценічного мікрометра

Використовується об'єктив	Загальне збільшення	Діаметр поля (мм)	Діаметр поля в (мкм)

Частина III: Виготовлення мокрих кріплень

Матеріали

Слайди (в алкогольній банці) Кришка ковзання (в алкогольній банці) Паперові рушники Лоток або склянка для миття гірки Щипці Перенесення пипец Ніж і обробна дошкаЗубочистки

Цибуля Йод (флакон-крапельниця) Метиленовий синій (пляшка-крапельниця) Лист Елодея (в склянці води) Ставок вода (в склянці) 20% солона вода (пляшка-крапельниця) Деіонізована вода (пляшка-крапельниця)

Підготовлені Слайди: Парамецій Спірогіра Мазок крові людини Серповидно-клітинна кров людини Мазок крові амфібії

Порядок дій

Клітини людини щоки

Малюнок 3. Клітина щоки людини при 400-кратному збільшенні.

Щока людини вистелена епітеліальними клітинами. Вони будуть використані сьогодні для вас, щоб спостерігати за еукаріотичними тваринами клітинами та його ядром. Ви зішкребете і пофарбуєте зразок клітин щоки барвником метиленовий синій. Барвник дозволить чітко фарбувати ядра клітин. Будьте обережні з барвниками, що використовуються для вологих кріплень, оскільки вони заплямують шкіру та одяг. Також гірки і кришки, які ви будете використовувати, зберігаються в спирті. Перед підготовкою слайдів для мокрого кріплення переконайтеся, що висушіть слайди та покриттягучі паперовими рушниками (не дорогим папером для лінз).

1. Отримайте сухий слайд мікроскопа і кришку ковзання.
2. На гірку покладіть краплю метиленового синього.
3. Акуратно зішкребти нутрощі щоки зубочисткою і закрутити її в барвнику на гірці.
4. Помістіть ковзання на підвіску та перегляньте із загальним збільшенням у 1000 разів
5. Намалюйте 1-3 клітини, достатньо великі, щоб показати деталі, які ви бачите у своєму лабораторному посібнику. Позначте його клітинну мембрану, цитоплазму і ядро. Обов'язково вкажіть використовуване збільшення та назву зразка. Також вкажіть передбачуваний розмір осередку в мікрометрах під вашим кресленням. Дивіться приклад (в якому відсутні мітки).

Елодея Лист Мокра гора

Клітинна мембрана не видно на листі Елодея через її близькість до набагато товстішої клітинної стінки. Для того щоб переглянути мембрану, ви додасте сіль в Елодея. Вода буде витікати з клітин Elodea шляхом осмосу, скорочуючи клітинну мембрану від жорсткої клітинної стінки (плазмоліз).

1. Отримайте слайд мікроскопа. Помістіть 2 краплі води Di зліва і 2 краплі 20% солі праворуч.
2. Дістаньте лист з стебла Елодея і розріжте лист навпіл. Помістіть в кожен розчин по половинці листочка.
3. Зачекайте 3-5 хвилин, а потім покладіть кришку ковзання над кожним листом (промокніть зайву воду).
4. Перегляд між загальним збільшенням 400X.
5. Шукайте клітини, які піддалися плазмолізу. Якщо жодного не знайдено, підготуйте слайд ще раз.
6. Намалюйте 2-3 з'єднаних осередку досить великих розмірів, щоб показати ту деталь, яку ви бачите. Позначте клітинну стінку, клітинну мембрану, цитоплазму та хлоропласти у своєму лабораторному посібнику. Обов'язково вкажіть використовуване збільшення та назву зразка. Також вкажіть передбачуваний розмір осередку в мікрометрах під вашим кресленням.

Малюнок 4. Клітини Елодея в 400x

Малюнок 5. Клітини Elodea
піддаються плазмолізу в 400x

Цибуля Мембрана Вологе кріплення

Цибулини цибулі - це фактично набряклі листя, які утворюють підземну структуру. Хоча і не є хорошим джерелом для перегляду хлоропластів, вони є відмінним джерелом для перегляду еукаріотичних ядер рослин.

Малюнок 6. Цибулеві клітини в 400x

1. Отримайте сухий слайд мікроскопа і кришку ковзання.
2. Наріжте крихітний квадрат з одного шару цибулі. За допомогою щипців очистіть тонку, білу прозору мембрану з внутрішньої увігнутої сторони цибулинної ділянки (вам потрібен лише невеликий шматочок, розміром приблизно з олівцевий ластик) і покладіть на гірку. Намагайтеся розгладити прозору цибулинну мембрану якомога рівніше.
3. Додайте в мембрану краплю йоду і почекайте 30 секунд. Накрийте мембрану кришкоюковскою. Помістіть гірку всередину складеного паперового рушника і обережно промокніть протягом 1 секунди, щоб видалити надлишок барвника.
4. Переглядайте або 100X або 400X загальне збільшення, так що ви можете побачити 2-3 клітинки.
5. Намалюйте 2-3 з'єднані клітини, досить великі, щоб показати деталь, яку ви бачите. Позначте клітинну стінку, ядро та цитоплазму. Обов'язково вкажіть використовуване збільшення та назву зразка. Також вкажіть передбачуваний розмір осередку в мікрометрах під вашим кресленням.

Ставок води Мокра гора

Ви підготуєте мокру гору одного з наступних протистів, які можна знайти у водоймі: Euglena, Spirogyra, Paramecium та/або Amoeba.

1. Отримайте поглиблення гіркою і висушіть її. Заглиблений слайд має вигнутий відступ посередині гірки, що дозволяє живності пересуватися і не розтискатися.
2. Покладіть краплю метилцелюлози і краплю зі ставка води або культур.
3. Акуратно надягаємо на чохл-ковзання. Якщо у вас на гірці занадто багато рідини, то акуратно скористайтеся куточком паперового рушника, щоб увібрати зайву рідину.
4. Перегляд при 100-кратному або 400X загальному збільшенні.

6. Намалюйте організми, які бачите. Обов'язково вкажіть використовуване збільшення та назву зразка. Також вкажіть передбачуваний розмір осередку в мікрометрах під вашим кресленням.

Підготовлені Слайди

Ви подивитеся на різні підготовлені слайди, включаючи парамецій, спірогіра, мазки крові людини, серповидно-клітинний червоний кров мазки, жаби крові мазки, і, можливо, інші. Переглядайте під мікроскопом, використовуючи найбільше збільшення для кращих клітинних деталей і намалюйте те, що ви бачите. Обов'язково вкажіть використовуване збільшення та назву зразка. Також вкажіть передбачуваний розмір осередку в мікрометрах під вашим кресленням.

Малюнок 7. Зразки при збільшенні 400 разів. Зліва направо: спірогіра, парамецій, мазок крові людини, серповидна клітина людини.

Частина IV: Лабораторний виїзд

Перевірте кожне завдання після завершення. Інструктор повинен підписатися перед зберіганням мікроскопа.

Повертається З'єднання Мікроскоп

• Поверніть лінзу об'єктиву низької потужності в положенні
• Використовуйте грубий фокус, щоб підняти носову частину вгору
• Видалити слайд зі сцени
• Слідкуйте за тим, щоб планка з сценічних затискачів не стирчала.
• Увімкніть реостат на найнижчий, перш ніж вимкнути світло
• Від'єднайте і оберніть шнур живлення відповідно до інструкцій інструктора
• Перенесіть мікроскоп належним чином до шафи і поверніться на правильну полицю

Очищення вологих кріплень

• Промийте гіркою в склянці води, зніміть і поверніть кришку ковзання і посуньте в правильні банки
• Покладіть підготовлені слайди назад на правильний лоток на демонстраційному столі
• Затягніть всі кришки для пляшок з реагентом.
• Очистіть демонстраційну таблицю
• Протріть всі столи вологою губкою

Підпис інструктора

Навчальні питання

1. На наступній сторінці позначте частини мікроскопа і перерахуйте їх функції.
2. Як правильно переноситься мікроскоп?
3. Як правильно прибрати мікроскоп?
4. Яка потужність збільшення:
   • Об'єктив високої потужності?
   • Об'єктив середньої потужності?
   • Об'єктив малої потужності?
   • Очна лінза?
5. Як визначається сумарне збільшення зразка?
6. Коли збільшення збільшується, як змінюється розмір поля зору?
7. Чому важливо розмістити середовище на гірці перед вибором зразка для монтажу?
8. Назвіть один із способів переконатися, що зразок буде знайдений у полі зору при зміні збільшення.
9. Які відмінні характеристики рослинної клітини порівняно з тваринною клітиною?
10. Знаючи розмір поля зору за допомогою однієї з трьох збільшувальних лінз, зможете визначити розмір спостережуваного зразка.

Малюнок 8. Порожній мікроскоп для маркування деталей.