1.16: Смак генетики - PTC дегустатор

Цілі навчання

Цілі:

• Розуміти основні ПЛР і гелевий електрофорез
• Щоб зрозуміти основні виявлення мутації ДНК
• Дізнатися, як рестрикційні ферменти включені в біотехнології

Результати навчання студентів:

Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

• Зрозумійте SNP
• Знати, як виконати екстракцію ДНК, ПЛР та рестрикційний дайджест
• Знати, як інтерпретувати гель ДНК після електрофорезу

Вступ

Кожен організм на Землі по-різному сприймає світ через свій індивідуальний життєвий досвід, а також генетичний склад. Люди нічим не відрізняються; кожна людина має свій власний досвід, який формує їхнє світосприйняття, але також робить їх ДНК. Ви можете бути здивовані, дізнавшись, що 99,9% генома людини ідентичні від однієї людини до іншої, і саме різниця в 0,1% робить кожну людину унікальною.

Деякі з цих відмінностей можуть вплинути на наші сенсорні системи та те, як ми сприймаємо природний світ. Наприклад, з часом ми дізналися, які речі смачні та корисні для нас, одночасно вивчаючи, які речі погані або погані для нас. Зокрема, гіркі сполуки тісно пов'язані з токсичними речовинами в природі. Те, як ми знаємо, що гіркий смак, або будь-який інший смак з цього приводу, полягає в тому, що у нас є спеціальні хімічні рецептори в роті та носі, які зв'язують молекули в нашій їжі і посилають сигнали в мозок, розповідаючи йому, як їжа на смак.

Малюнок 1: Хімічне зв'язування мембранного рецептора

Один тип гіркого рецептора в нашому роті відчуває наявність хімічної речовини під назвою фенілтіокабамід, або PTC. PTC - нетоксична хімічна речовина, але вона дуже нагадує токсичні сполуки, які часто зустрічаються в їжі. Унікальна річ у PTC полягає в тому, що не кожен може спробувати його! Ми вперше дізналися про це в 1920-х роках, коли Артур Л. Фокс і К.Р. Ноллер працювали з порошком PTC, а Ноллер скаржився на надзвичайно гіркий смак, тоді як Фокс взагалі нічого не скуштував. Це призвело до експериментів, де вчені в кінцевому підсумку виявили, що здатність смакувати PTC була спадковою; це було в нашій ДНК!

Перш ніж говорити про генетику дегустації PTC, спочатку потрібно зрозуміти деяку термінологію. Спостережувана риса, така як здатність до смаку ПТК, називається фенотипом. Генетична інформація, яка кодує для цього фенотипу, називається генотипом. Гени, що складають генотип, походять від батьків у вигляді алелів; один алель від матері і один алель від батька. Дві копії можуть бути однаковими алелями, гомозиготними, або дві копії можуть бути різними, гетерозиготними.

Здатність смакувати PTC походить від гена TAS2R38, який кодує один з хімічних рецепторів у нашому роті, який зв'язується з PTC. Порівнюючи дегустатори PTC з нетагустаторами, вчені виявили три однонуклеотидні поліморфізми (SNP), які відрізняють алель дегустатора (T) від несмакового алеля (t). SNP - це генетична мутація, де один нуклеотид в ДНК відрізняється від однієї особини до іншої. Слово мутація звучить страшно, але мутація не завжди погано; є майже 10 мільйонів SNP у людей, що означає, що SNP є загальними. Три SNP (див. Таблицю 1), знайдені в гені TAS2R38, призводять до змін послідовності амінокислот, які потенційно можуть змінити функцію білків.

Таблиця 1. SNP присутні в дегустаторах проти нетагустаторів для PTC

Положення нуклеотидів (bp)	Зміна нуклеотидів		Зміна кодону		Зміна амінокислот
	фенотип	Нет-дегустатор	Дегустатор	Нет-дегустатор	Дегустатор	Нет-дегустатор	Дегустатор
145	Г	C	Г СА	C CA	Аланін	Пролін
785	Т	C	Г Т Т	Г С Т	Валін	Аланін
886	A	Г	А ТК	Г ТК	Ізолейцин	Валін

Перш ніж з'ясувати свою дегустаційну здатність, давайте спочатку зрозуміти генетику алелів. Особи, які є дегустаторами, можуть бути ТТ (гомозиготна домінанта) або Tt (гетерозиготна). Особи, які не є дегустаторами, завжди будуть tt (гомозиготний рецесив). Щоб зрозуміти, як успадковуються гени, вивчіть таблицю 2 нижче, де аналізуються потенційні потомства двох гетерозиготних батьків. Існує 75% шанс мати дітей, які є дегустаторами для PTC, і 25% шанс мати дітей, які не є дегустаторами.

Таблиця 2. Зразок шаблону успадкування для дегустації PTC

Батьківські алелі	Т	т
Т	ТТ (гомозиготний дегустатор)	Tt (гетерозиготний дегустатор)
т	Tt (гетерозиготний дегустатор)	тт (гомозиготний нетагустатор)

Ми розберемося з вашим генотипом сьогодні за допомогою трьох дуже часто використовуваних аналізів у галузі біотехнології. Перший - це полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка використовується для вибіркової ампліфікації певної ділянки цікавить ДНК. ПЛР дозволяє нам взяти одну або дві копії ДНК і зробити їх мільйони, полегшуючи нам аналіз результатів. Потім ми виконаємо рестрикційний дайджест з рестрикційними ферментами. Рестрикційні ферменти схожі на «молекулярні ножиці», оскільки вони розрізають ДНК на конкретних нуклеотидних послідовностях, які називаються місцями роз Для цієї лабораторії ви будете використовувати рестрикційний фермент під назвою HaeIII, який розпізнає послідовність GGCC. Коли HaeIII натрапив на послідовність розпізнавання, фермент розрізає ДНК між нуклеотидами G і C, виробляючи дві нитки ДНК різного розміру. Для візуалізації ДНК ми проведемо гелевий електрофорез, наш третій аналіз, який дозволяє відокремлювати молекули ДНК залежно від їх розміру. Очікувані результати дивіться на малюнку 2 нижче.

Малюнок 2:. Очікувані результати гелю електрофорезу після рестрикції дайдже

Частина I: День 1

Матеріали

Малюнок 3. День 1 Реагенти

Реагенти

• PTC папір
• Малі мікроцентрифуги/ПЛР-пробірки
• 0,9% сольовий розчин
• Розчин для екстракції
• Taq майстер-мікс
• Грунтовка суміш

Обладнання

• Мікропіпетки P-20 і P-200 і одноразові наконечники
• Мікроцентрифуга
• ^{Термоциклер для водяної бані при 95° С}
• Відро для льоду або запрограмований термоциклер
• Морозильна камера -20 ^o C

Процедура (відповідно до рекомендацій виробника)

1. Покладіть одну смужку паперу PTC на кінчик язика і запишіть, гіркий він на смак чи ні. Викиньте використаний папір PTC у біологічних відходах
   • Гіркий
   • Чи не гіркий
2. Підрахуйте учнів у класі, щоб визначити кількість дегустаторів та недегустаторів та розмістіть цю інформацію у полі нижче:

Таблиця 3. Дані класу

фенотипи	Кількість студентів	% Всього
PTC дегустатор
PTC Нет-дегустатор
Всього

3. Позначте 2 пробірки ПЛР та чашку сольового розчину своїм ідентифікатором
4. Налийте 0,9% сольовий розчин в рот і енергійно покрутіть протягом 2 хвилин, щоб вибити клітини в роті. Ось звідки буде надходити ДНК в нашому експерименті.
5. Піпетка 200 мкл вашої суміші слини/сольового розчину в одну з маркованих пробирок ПЛР (невелика мікроцентрифужна трубка) і щільно закрийте пробірку ПЛР.
6. Центрифугуйте пробірку ПЛР, що містить слину/фізіологічний розчин, при 8000 об/хв протягом 3 хвилин.
7. Шукайте гранулу білих клітин в нижній частині трубки. Обережно видаліть супернантант, додавши супернантант від гранул і викиньте в контейнер для біологічних відходів. Будьте обережні, щоб не порушити клітинну гранулу!
8. Додайте 50 мкл екстракційного розчину в пробірку ПЛР з клітинною гранулою. Ресуспендуйте клітини шляхом змішування за допомогою мікропіпетки і продовжуйте робити це, поки клітинна гранула не буде розбита і більше не буде великих скупчень клітин.
9. Вам потрібно інкубувати пробірку при 95° C протягом 5 хвилин, щоб розбити клітини і випустити ДНК в розчин з подальшим охолодженням до готовності до використання. Можна помістити трубочку на лід, щоб охолодити її. Якщо використовується система MiniOne, помістіть трубку в апарат ПЛР. Використовуючи мобільний пристрій з мобільним додатком MiniOne PCR, запрограмуйте апарат ПЛР у режимі постійної температури для інкубації зразків при 95°С протягом 5 хвилин. Введіть 4° C для кінцевої температури інкубації. Це збереже ваші зразки холодними, поки ви не зможете їх забрати. (Таблиця 4)
   

   Таблиця 4 Програма лізису клітин

   Крок	Тривалість	Температура
   Клітинний лізис	5 хв	95⁰C
   Остаточна інкубація	∞	4⁰C

10. Отримайте пробірки для ПЛР та центрифугу протягом 1 хвилини при 8000 об/хв для збору залишків клітин на дні трубки. Ваша ДНК тепер буде знайдена в супернатанті трубки.
11. Не порушуючи гранулу на дні, обережно піпетуйте 5 мкл ДНК, що містить супернатант, у вашу ^2-ю мічену ПЛР-пробірку.
12. До вашої ПЛР-пробірки, що містить ДНК, додайте 10 мкл Taq Master Mix та 5 мкл суміші грунтовки. Переконайтеся, що не розміщуйте міхур на дні пробірки ПЛР, оскільки це може вплинути на реакцію ПЛР.
13. Щільно закрийте трубку, обережно натисніть трубку для перемішування, потім центрифугуйте протягом 15 секунд при 8000 об/хв, щоб довести всю рідину до дна трубки.
14. Помістіть пробірку ПЛР в термоциклер. Коли всі зразки завантажені, закрийте кришку та дотримуйтесь вказівок інструктора, щоб налаштувати протокол ПЛР, як показано в таблиці 16.5.
15. Після завершення протоколу вийміть зразок з термоциклера і поставте при температурі -20⁰C до наступного періоду заняття.

Таблиця 5. Програма ПЛР

Крок	Тривалість	Температура	Цикли
Початкова денатурація	30 сек	94⁰C
Денатурація	5 сек	94⁰C	30 циклів
Відпал	10 сек	62⁰C
Розширення	15 сек	72⁰C
Остаточна інкубація	∞	4⁰C

Частина II: День 2

Малюнок 4. День 2 Реагенти

МАТЕРІАЛИ

Реагенти

• Зберігається заморожений зразок попереднього періоду
• Нова ПЛР-трубка
• Фермент рестрикції HaEIII
• Буфер для розведення
• Агарозний гель з гелем Зелений
• Завантаження барвника
• Запуск буфера (TBE)
• Маркер ДНК

Обладнання

• Водяна баня або програмований термоциклер
• Лоток для гелевого лиття та гребінець
• Блок гелевого електрофорезу
• Мікроцентрифуга
• Синій світловий короб
• Фото документація обладнання

Порядок дій

1. Отримайте пробірку ПЛР з попередньої лабораторної сесії
2. Розділіть реакцію на дві частини, додавши 10 мкл продукту ПЛР у чисту пробірку для ПЛР. Позначте один «U» для неперетравленого, а інший «D» для перетравленого.
3. Додайте 5 мкл ферменту рестрикції HaEIII до трубки «D» та буфер для розведення ферменту 5 мкл до трубки «U». Закрийте трубочки і акуратно проведіть пальцями, щоб перемішати. Центрифугуйте пробірки протягом 15 секунд при 8000 об/хв, щоб зібрати всю рідину на дно трубки.
4. Помістіть свої трубки у відповідну водяну баню або термоциклер, скориставшись настройками таблиці 5. При використанні системи ПЛР MiniOne налаштуйте інкубацію для рестрикційного дайджесту при 37⁰C протягом 15 хвилин, використовуючи постійний температурний режим. Введіть 4⁰C для остаточної інкубації. (Див. Таблицю 6)
   

   Таблиця 6. Програма дайджест HaeIII

   Крок	Тривалість	Температура
   Інкубація HeII	15 хв	37⁰C
   Остаточна інкубація	∞	4⁰C

5. Поки ви чекаєте свого переварювання, приготуйте гель з агарози. Вам знадобиться барвник, такий як гель зелений, включений для візуалізації ДНК в гелі. Lab 11 має більш докладну інструкцію, якщо ви не використовуєте комплект. Для набору MiniOne гель зелений входить в заздалегідь виміряну кількість агарози. Проткніть невеликий отвір у пластику поверх гелевої чашки, щоб пара виходила. Мікрохвильові гелі з кроком 20 секунд до повного розчинення гелю і в рідкому стані. Налийте свій гель у лоток для лиття, використовуючи 9-луночну сторону гребінця. Дайте вашому гелю застигнути (при висиханні він буде кілька непрозорим).
6. Коли інкубація завершена, витягніть зразки. Додайте 3 мкл завантажувального барвника до кожної з ваших трубок, що містять ДНК. Закрийте трубку і обережно натисніть, щоб змішати реагенти. Центрифугуйте пробірки протягом 15 секунд при 8000 об/хв, щоб збити рідину на дно трубки.
7. Отримайте блок електрофорезу. Для гелевого бака MiniOne переконайтеся, що чорна платформа знаходиться в резервуарі, щоб допомогти у візуалізації. Помістіть свій гель у резервуар і переконайтеся, що лунки знаходяться на негативному кінці гелевої коробки.
8. Налийте біговий буфер TBE в резервуар і переконайтеся, що гель повністю занурений буфером. Неповне занурення гелю призведе до заливання результатів в гелі електрофорез.
9. Увімкніть синє світло низької інтенсивності та завантажте 10 мкл вашого неперетравленого зразка та 10 мкл неперетравленого зразка в дві сусідні лунки гелю. Переконайтеся, що ваша група також завантажує маркер ДНК в одну з лунок. Ваша група може використовувати 10 мкл маркера ДНК MiniOne®. Використовуйте таблицю 6 нижче, щоб відстежувати, які зразки завантажені в які свердловини.
   

   Таблиця 7. Завантажені зразки

   Колодязь	1	2	3	4	5	6	7	8	9
   Зразок

10. Увімкніть систему електрофорезу MiniOne, помістивши помаранчеву кришку на машину та натиснувши кнопку живлення. Повинно включитися зелене світло і в буферному розчині повинні бути видні невеликі бульбашки. Запускайте зразки протягом 20 хвилин, щоб забезпечити належне поділ смуг. При використанні іншої системи електрофорезу запустіть гель на 135 В, поки смуги не відокремлюються достатньо, а фронт барвника пройшов близько 70% вниз по гелю.
11. Наприкінці пробігу увімкніть синє світло високої інтенсивності та скористайтеся телефоном, камерою або системою документації гелю, щоб сфотографувати гель. Синє світло робить гель зеленим, який включений в молекули ДНК, флуоресцентним, щоб їх можна було візуалізувати.
12. Проаналізуйте гель на основі інформації, наданої при введенні цієї лабораторії.
13. Утилізуйте свій гель і буфер TBE відповідно до інструкцій інструктора.

Навчальні питання

1. Якщо хтось може скуштувати PTC, що таке/є їх можливим генотипом?
2. Якщо хтось гомозиготний за ознакою проти гетерозиготного, при порівнянні їх результатів на гелевому електрофорезі, які відмінності, якщо такі є, ви очікуєте побачити.
3. Коли ви використовували ПЛР для ампліфікації гена TAS2R38, який компонент реакції робить його специфічним для цього гена у вашому геному, а не для іншого гена?
4. Рестрикційні ферменти розпізнають дуже специфічні послідовності в ДНК. Вони читають однаково вперед і назад. Як називаються ці типи послідовностей?
5. Якщо ви не бачили жодних смуг у вашій реакції після електрофорезу, що могло піти не так? Перерахуйте дві можливі причини такого результату.
6. Після порівняння ваших груп з діапазонами маркерних ДНК, чи відповідають ваші групи та групи ваших однокласників очікуваним розмірам?
7. Чи відповідають ваші результати аналізу діапазону ДНК вашого фенотипу як дегустатора або нетагустатора на основі смаку паперу? Що ви очікували побачити для різних фенотипів у класі?

Атрибуції

Ця лабораторія ліцензована як CC BY-NC-SA. Назва, малюнок 2 та процедура взяті з лабораторії, розробленої Embi Tec і використовуються з дозволу.