Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.6: Спектрофотометрія

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6255

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Визначте основні ознаки на спектрофотометрі та визначте їх функції.
    • Використовуйте спектрофотометр для отримання спектра поглинання.

    Результати навчання студентів:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:
    • Визначте частини спектрофотометра та пов'язані з ними функції.
    • «Бланк» спектрофотометр.
    • Отримати спектр поглинання для молекули.
    • Використовуйте сканування поглинання довжини хвилі, щоб визначити барвники в кольорових кеглі.

    Вступ

    Спектрофотометри є одним з найбільш часто використовуваних вченими інструментів для визначення як присутності, так і концентрації розчинених хімічних речовин. Оскільки промениста енергія (видиме світло) вражає речовину, молекули будуть поглинати певні довжини хвиль світла і передавати або відображати інші на основі природи їх хімічних зв'язків. Наприклад, білки і нуклеїнові кислоти поглинають довжини хвиль в діапазоні видимого світла 240-300 нанометрів (нм), пігменти та барвники поглинають світло в діапазоні 400-770-нм, а інші органічні молекули поглинають довжини хвиль вище 770-нм. Кожна хімічна речовина має характерне атомне розташування та візерунок зв'язку, і, таким чином, поглинає або передає різні довжини хвиль видимого світла в унікальному для цього хімічного зразку. Ця унікальна картина поглинання та пропускання світла створює «відбиток пальця» для цієї хімічної речовини. У цій вправі ви визначите унікальний «відбиток пальця» для кольорової молекули і за допомогою спектрофотометра виміряєте концентрацію хімічної речовини в даному зразку.

    поглинання graph.jpg
    Малюнок 1: Крива поглинання та пропускання світла

    Спектрофотометри - це прилади, призначені для виявлення кількості світлової енергії, яка поглинається або передається молекулами, розчиненими в розчині. Оскільки молекули мають довжини хвиль, унікальні для їх структури, різні хімічні речовини та їх концентрації можуть бути ідентифіковані на основі їх поглинання або пропускання.

    спектофотометр з деталями, маркованими
    Малюнок 2. Марковані частини спектрофотометра

    Спектрофотометр - це прилад, який використовується для виявлення наявності будь-яких світлопоглинаючих частинок, розчинених у розчині, і для вимірювання концентрації цих частинок. Джерело світла всередині спектрофотометра випромінює повний спектр білого світла до відсіку, де розміщується рідина для зразків. Зразки готуються в кюветах, які виготовляються з використанням спеціалізованих пластмас або кварцу, щоб вони не поглинали світло і не впливали на наші вимірювання. Перед тим, як світло пройде через зразок в кюветі, регульована призма і дифракційна решітка фільтрують світло так, що тільки одна довжина хвилі світла може бути обрана і дозволена проходити через зразок. Всі молекули відрізняються тим, наскільки сильно вони поглинають кожну довжину хвилі світла у видимому спектрі через відмінності в їх молекулярній структурі і складі. Це дозволяє нам використовувати певну довжину хвилі світла для виявлення присутності та кількісної оцінки однієї молекулярної сполуки в простій або складній рідкій суміші. Спектрофотометри також калібруються за допомогою «порожнього» розчину, який ми готуємо, що містить всі компоненти розчину, що підлягають аналізу, за винятком однієї сполуки, яку ми тестуємо, щоб прилад міг обнулити ці фонові показання і лише повідомляти значення для сполуки, що цікавить.

    Світло, що проходить через розчин зразка, частково поглинається молекулами, присутніми у зразку. Кількість світла, нездатного пройти через зразок, вимірюється як значення поглинання. Поглинання прямо пропорційно концентрації молекул і вимірюється за логарифмічною шкалою від 0 до нескінченності. Кількість світла, яке не поглинається, передається або пропускається через зразок. У порівнянні з кількістю світла, що надходить на зразок, кількість, що виходить, вимірюється у відсотках від проданого світла. Відсоток пропускання обернено пропорційний концентрації молекул у зразку і вимірюється за лінійною шкалою від 0% до 100%.

    Кювета з фіолетовим пучком світла, що проходить крізь неї
    Малюнок 3: Світло поглинається і передається через кювету і розчин спектрофотометра

    Фотоприймач на іншій стороні відсіку для зразків перетворює інтенсивність світла, яке він отримує, в електричний сигнал. Потім прилад може обчислити та відображати значення поглинання та% пропускання, вимірюючи різницю між інтенсивністю світла обраної довжини хвилі, що надходить та виходить із зразка.

    Шкала поглинання відображає вимірювання кількості світла, поглиненого та перетвореного в одиниці поглинання (\(A\)) спектрофотометром. Одиниці поглинання розраховуються за допомогою наступного рівняння:

    Рівняння 1

    \[\text{Absorbance} (A) = \log_{10} \left(\dfrac{1}{T}\right) \nonumber\]

    де «\(T\)» - десяткова форма «\(\%T\)»

    \[T = \dfrac{\%T}{100} \nonumber\]

    Приклад

    Якщо виявлено, що розчин, що містить даний барвник, пропускає 10% світла при розміщенні в спектрофотометрі, його поглинання тоді буде розраховуватися наступним чином:

    Коефіцієнт пропускання (Т) = 10% = 10% /100 = 0,10

    Поглинання (А) = журнал 10 (1/0,10) = 1,0

    Частина I: Визначення харчових барвників у цукерках

    Багато продуктів харчування, ліків та косметики штучно пофарбовані федерально затвердженими харчовими барвниками (барвники FD & C). Ці барвники включають червоний 40, червоний 3, жовтий 5, жовтий 6, синій 1 та синій 2. Оскільки кожен барвник має ідентифікований спектр поглинання та пік, спектрофотометр може бути використаний для ідентифікації типів барвника FD & C, що використовуються у продукті.

    Пігменти можуть бути витягнуті з продуктів і напоїв, які містять один або кілька з цих барвників. Спектр поглинання цього екстракту може потім визначити, які барвники знаходяться в цій їжі або напої, порівнюючи піки максимального поглинання з інформацією в таблиці нижче. Якщо спектр поглинання харчового екстракту має пік в 630 нм і один на 428 нм, можна припустити, що їжа містить як синій #1, так і жовтий #5. Наступна таблиця дає довжину хвилі пікового поглинання для кожного з цих барвників.

    Таблиця 1. Довжина хвилі максимального поглинання зазвичай використовуваних барвників FD & C
    FD & C Барвник Ім'я Довжина хвилі (нм) максимального поглинання
    Блакитний #1 Блискучий синій FCF 630
    Зелений #3 Суцільний зелений FCF 625
    Блакитний #2 Індиго Кармін 610
    Червоний #3 еритрозин 527
    Червоний #40 Червоний колір AC 502
    Жовтий #6 Захід сонця жовтий FCF 484
    Жовтий #5 Тартразин 428

    Матеріали

    • Спектрофотометр
    • Кювета
    • кеглі
    • Серветки KIM
    • пробірки

    Порядок дій

    А. витяг барвника з цукерок (Ваш інструктор зробить це за вас)

    Вам знадобиться одна пробірка і одна кювета для кожного кольору, який потрібно перевірити. Відміряйте 4 мл води в один тюбик. Помістіть 2-4 цукерки одного кольору в пробірку з водою. Акуратно закрутіть, і почекайте одну хвилину. Після, вилийте приблизно 1 мл рідини в пробірку мікроцентрифуги. Обертайте мікроцентрифужну трубку з максимальною швидкістю протягом 60 секунд. Переконайтеся, що центрифуга збалансована перед віджиманням. Перенесіть прозору рідину (супернатант) в кювету. Переконайтеся, що залиште після себе частинки (гранули).

    Графік з віссю x як довжиною хвилі та віссю y як поглинання. Пік знаходиться на рівні 450 за шкалою довжини хвилі.
    Малюнок 4. Крива поглинання

    Б. вимірювання поглинання за допомогою спектрофотометра

    1. Увімкніть спектрофотометр. Дайте йому прогрітися протягом 15 хвилин.
    2. Виберіть сканування довжини хвилі.
    3. Заповніть кювету 2/3 водою DI, щоб служити кюветою «BLANK».
    4. Калібрування спектрометра
      1. Протріть зовнішню частину BLANK кювети KimWipe
      2. Помістіть кювету в машину так, щоб чіткі частини кювети були орієнтовані зліва направо. (Світло повинно пройти через чисту область на кюветі).
      3. Натисніть «Нуль»
      4. Зніміть заготовку.
    1. Визначте оптимальне поглинання довжини хвилі та налаштуйте режим збору даних.
      1. Помістіть кювету зі зразком в спектрофотометр
      2. Натисніть «читати»
      3. Встановіть режим курсора на пік і долину в розділі «Параметри» > «Більше» > «Режим курсору»
      4. Натисніть стрілки вліво і вправо праворуч від графіка, щоб вибрати найвищу вершину.
      5. Запишіть довжину хвилі і поглинання в таблиці 6.2.
    1. Вирішіть, які барвники використовувалися для виготовлення кожного кольору. Введіть довжину хвилі цього барвника в останньому стовпці таблиці 6.2. Поясніть свої міркування щодо кожного вибору у вашому лабораторному блокноті.

    Результати

    Таблиця 2.

    Колір кеглі

    Максимальне поглинання

    Довжина хвилі (нм) при максимальному поглинанні

    Пропонований барвник

    Довжина хвилі (нм) максимального поглинання для пропонованого барвника

    Червоний

    		        

    Помаранчевий

    		        

    Жовтий

    		        

    Зелений

    		        

    Фіолетовий

    		        

    Інструкція по чищенню кюветів

    1. Відмовтеся від рішень для раковини
    2. Промити водою з-під крана один раз
    3. Змийте водою DI два рази
    4. Помістіть у стійку для труб, дайте висохнути на повітрі

    Навчальні питання

    1. Назвіть частини спектрофотометра і визначити їх функцію.
    2. Яка різниця між% пропускання та поглинання?
    3. Як ви визначили, яка довжина хвилі була поглинена на найвищому рівні? Чим корисний цей процес при визначенні ідентичності молекули?
    4. Як чистити кювету?