Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.10: Функція ферменту

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6224

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Проведіть кольорометричний аналіз для контролю активності амілази.

    РЕЗУЛЬТАТИ НАВЧАННЯ СТУДЕНТІВ:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

    • Опишіть, як працює фермент.
    • Поясніть вплив температури на швидкість хімічних реакцій.
    • Поясніть вплив рН на активність ферментів.

    Вступ

    Живі організми підтримують життєдіяльність, проводячи тисячі хімічних реакцій щохвилини. Ці реакції не відбуваються випадково, а контролюються біологічними каталізаторами, званими ферментами. Ферменти прискорюють швидкість хімічних реакцій, знижуючи енергію активації, необхідну для запуску реакції. Без ферментів хімічні реакції не відбулися б досить швидко, щоб підтримувати життя. Ферменти, як правило, білки, і кожен складається з певної послідовності амінокислот. Водневі зв'язки утворюються між конкретними амінокислотами і допомагають створити тривимірну форму, унікальну для кожного ферменту. Форма ферменту, особливо його активна ділянка, диктує каталітичну специфічність того чи іншого ферменту. Кожен фермент буде зв'язуватися тільки з конкретними молекулами, так як ці молекули повинні відповідати з активною ділянкою на ферменті, як замок і ключ.

    Молекула, яка зв'язується з ферментом і піддається хімічній перестановці, називається субстратом. Фермент «Е» з'єднується з молекулою (ами) субстрату «S» на активній ділянці і утворює тимчасовий ферментно-субстратний комплекс «ЕС», де і відбувається специфічна реакція. Модифікована молекула субстрату є продуктом «Р» реакції. Продукт відокремлюється від ферменту, а потім використовується клітиною або організмом. Фермент не споживається і не змінюється реакцією і може використовуватися в інших каталітичних реакціях, якщо доступні додаткові молекули субстрату.

    Реакція 1

    \[\ce{E + S -> ES -> E + P}\nonumber\]

    Окрема молекула ферменту може полегшити кілька тисяч каталітичних реакцій в секунду, і тому для перетворення великої кількості молекул субстрату в продукт потрібна лише невелика кількість ферменту. Кількість конкретного ферменту, знайденого в клітині в будь-який момент часу, відносно швидкості синтезу ферменту в порівнянні зі швидкістю, з якою він розкладається. Якщо ферменту немає, хімічна реакція, каталізована цим ферментом, не відбудеться з функціональною швидкістю. Однак, коли концентрація ферменту збільшується, швидкість каталітичної реакції буде збільшуватися до тих пір, поки молекули субстрату будуть доступні.

    Різні фактори можуть інактивувати або денатурувати ферменти, змінюючи їх 3-вимірну форму та пригнічуючи ефективність зв'язування субстрату. Багато ферментів найкраще функціонують у вузькому діапазоні температур та рН, оскільки суттєві зміни температури або рН порушують їх водневі зв'язки та змінюють їх форму. Зміна форми ферменту зазвичай змінює форму активної ділянки і впливає на його здатність зв'язуватися з молекулами субстрату. Саме унікальна структурна схема зв'язку ферменту визначає його чутливість до зміни температури і рН.

    У наступній вправі ви вивчите вплив рН та температури на активність ферменту амілази. Амілаза міститься в слині людини та інших тварин, які споживають крохмаль як частину свого раціону. Крохмаль - це рослинний полісахарид, що складається з багатьох молекул глюкози, пов'язаних між собою. Амілаза контролює початкове перетравлення крохмалю, розщеплюючи його на молекули дисахаридної мальтози. Мальтоза в кінцевому підсумку розщеплюється на молекули глюкози в тонкому кишечнику, коли інші ферменти використовуються.

    креслення розгалуженої структури крохмалю з міченою частиною, що показує субодиниці глюкози. Також показана мальтоза, дисахарид з 2 субодиницями глюкози.
    Малюнок 1: Розгалужена структура крохмалю.

    Швидкість, з якою крохмаль перетравлюється в мальтозу, є кількісним виміром ферментативної реакції. Швидкість деградації крохмалю відносно швидкості, з якою виробляється мальтоза, проте його легше перевірити на наявність крохмалю, ніж вимірювати швидкість вироблення мальтози. I 2 KI буде використовуватися в якості індикатора наявності крохмалю. Коли крохмаль присутній, I 2 Ki виходить синьо-чорний колір. При наявності мальтози I 2 КІ не вступить в реакцію і залишається бурштинового кольору.

    Реакція 2

    \[ Starch + I_2KI \rightarrow \text{Dark Blue-Black color} \nonumber\]

    Реакція 3

    \[ Maltose + I_2KI \rightarrow \text{Amber color} \nonumber\]

    Вашій групі буде призначено для проведення однієї або декількох з наступних видів діяльності (частково або повністю):

    Вплив рН на активність амілази

    II. Вплив температури на активність амілази

    Результати кожної вправи будуть представлені класу, а учні будуть відповідати за інформацію та результати всіх вправ.

    Частина I: Вплив рН на активність амілази

    Кожен фермент має оптимальний рН, при якому він є найбільш активним або ефективним. Зміна рН може змінити зв'язки 3-мірної форми ферменту і спричинити зміну ферменту форми, що може уповільнити або заборонити зв'язування субстрату з активною ділянкою. Ви визначите, як pH впливає на активність амілази в цій вправі.

    Перш ніж почати цей експеримент, сформулюйте гіпотезу, яку ви хочете перевірити, і прогноз, щоб оцінити вашу гіпотезу, і запишіть їх у лист даних в кінці вправи.

    Матеріали

    • пробірки
    • Буфери (рН: 1,0, 5,0, 10,0)
    • Мікропіпетки
    • Стерильні наконечники для піпеток
    • 1% розчин крохмалю
    • I 2 KI розчин
    • колодязна плита
    • 0,5% розчин амілази
    • Таймер

    Порядок дій

    1. Етикетка 3 пробірки #1 - #3. Починаючи з трубки #1 і pH 1, позначте по одній трубці кожен з наступних буферних рН: 1,0, 5,0 і 10,0 (див. Таблицю 1 нижче). Після того, як ви позначили пробірки, використовуйте мікропіпетку P-1000 і додайте 4,0 мл відповідного буфера в кожну пробірку (4,0 мл рН 1,0 буфера до трубки #1, 4,0 мл буфера pH 5,0 до трубки #2 тощо). Обов'язково покладіть новий наконечник на мікропіпетку для кожного буфера.
      Ну пластини, деякі з бурштиновою рідиною в них.
      Малюнок 2. Колодязні плити
    2. Використовуючи мікропіпетку P-1000, додайте 2,0 мл 1% розчину крохмалю в кожну трубку і перемішайте, обережно закрутивши трубку і постукуючи дном трубки до долоні.
    3. Помістіть 2 краплі I 2 KI в відсіки декількох рядів тестової пластини так, щоб 24 відділення мали в них прозору бурштинову рідину.
    4. Починаючи з Tube #1 тільки зараз, виконайте наступне:
    5. Використовуючи чистий новий наконечник на мікропіпетці П-200, витягніть з пробірки 50,0 мікролітра рідини і дозуйте її в перший відсік тестової пластини, що містить I 2 KI. Суміш повинна вийти темно-синього або чорного кольору. (Це підтверджує, що крохмаль присутній у вашій пробірці перед додаванням ферменту в пробірку.)
      • Не торкайтеся I2KI наконечником піпетки!
      • Якщо ви це зробите, витягніть наконечник і поміняйте на новий чистий.
    6. Додайте 400,0 мкл 0,5% розчину амілази за допомогою мікропіпетки P-1000. Почніть запис часу в секундах з моменту додавання амілази. Змішайте вміст трубки, закрутивши трубку і обережно постукуючи дном трубки до долоні. Приступайте до наступного кроку негайно (протягом 20 секунд).
    7. Рівно за 20 секунд перенесіть 50.0 мкл (використовуючи мікропіпетку P-200) реакційної суміші з трубки #1 в наступний новий відсік, що містить I 2 KI на тестовій пластині.
      • Не торкайтеся I2KI наконечником піпетки!
      • Ви можете продовжувати використовувати ту саму пораду для кроку 8 нижче, поки він залишається незабрудненим.
    8. Повторюйте крок 7 кожні 20 секунд, використовуючи наступний новий відсік на тестовій пластині. Продовжуйте до тих пір, поки синьо-чорний колір більше не виробляється і розчин I 2 KI не залишиться бурштиновим (вказує на те, що крохмалю не залишається). Потім порахуйте загальну кількість відсіків, які дійсно змінювали кольори плюс на те, що не змінювали кольору і помножте на 20. Запишіть час, необхідний для повного перетравлення крохмалю, в табл. 1.

      Якщо колір I 2 KI продовжує змінюватися на темніший колір після загальної кількості 8 хвилин тестування, припиніть тестування цієї реакційної суміші, запишіть 480 секунд як час у таблиці даних, і перейдіть до кроку 9.
    9. Повторіть кроки 5 - 8, використовуючи трубку #2, потім #3. Можливо, вам доведеться очистити тестову пластину, промивши її водою DI, постукуючи її насухо, а потім додаючи в відсіки свіжий I 2 KI.
    Таблиця даних 1

    Трубка

    рН

    Час перетравлення крохмалю (сек)

    1

    1

    2

    5

    3

    10

    Аналіз даних

    1. Як би ви інтерпретували результати, наведені в таблиці 1?

    Частина II: Вплив температури на активність амілази

    Хімічні реакції прискорюються при підвищенні температури. Підвищення температури на 10 o C зазвичай призводить до двох-триразового збільшення швидкості реакції. Однак при високих температурах білки можуть бути необоротно денатуровані і зв'язування субстрату заборонено. Активність ферменту залежить від його правильної структури, а оптимальна температура для активності може змінюватися в залежності від структури ферменту.

    Перш ніж почати цей експеримент, сформулюйте гіпотезу, яку ви хочете перевірити, і прогноз, який можна використовувати для оцінки вашої гіпотези. Запишіть їх в техпаспорт в кінці вправи.

    Матеріали

    • пробірки
    • Мікропіпетки
    • Стерильні наконечники для піпеток
    • DI вода
    • Гаряча водяна баня (80 о С і 37 о С)
    • Крижана ванна (4 o C)
    • 1% розчин крохмалю
    • I 2 KI розчин
    • колодязна плита
    • 0,5% розчин амілази
    • Таймер

    Процедури

    1. Етикетка 3 пробірки #1 - #3.
    2. За допомогою мікропіпетки П-1000 додайте в кожну пробірку 1,0 мл 1% розчину крохмалю.
    3. Використовуючи новий наконечник на мікропіпетці P-1000, додайте 3,0 мл води DI в кожну трубку.
    4. За допомогою нового наконечника на мікропіпетці P-1000 додайте 1,0 мл буфера pH 5.0 до кожної трубки.
    5. Помістіть пробірки наступним чином: пробірка #1 в 80 o C водяній бані, пробірка #2 в 37 o C водяній бані (або інкубатор), Tube #3 в подрібненому льоду (4 o C).
    6. Нехай всі 3 трубки сидять у зазначених середовищах принаймні 15 хвилин.
    7. Помістіть 2 краплі I 2 KI в відсіки декількох рядів тестової пластини так, щоб 24 відділення мали в них прозору жовту рідину.
    8. Починаючи з tube #1, виконайте наступне:
    9. Використовуючи CLEAN NEW TIP на мікропіпетці П-200, витягніть з пробірки 50,0 мікролітра рідини і дозуйте її в перший відсік тестової пластини, що містить I 2 KI. Суміш повинна вийти темно-синього або чорного кольору. (Це підтверджує, що крохмаль присутній у вашій пробірці перед додаванням ферменту в пробірку.) НЕ ЧІПАЙТЕ I 2 КИ КІНЧИКОМ ПІПЕТКИ! Якщо ви це зробите, витягніть наконечник і поміняйте на новий чистий.
    10. Додайте 400,0 мкл 0,5% розчину амілази за допомогою мікропіпетки P-1000. Почніть запис часу в секундах з моменту додавання амілази. Змішайте вміст трубки, закрутивши трубку і обережно постукуючи дном трубки до долоні. Перейдіть до наступного кроку негайно (протягом 20 секунд)

    ВАЖЛИВО! Залиште трубки в температурних середовищах, коли вони тестуються!

    1. Рівно за 20 секунд перенесіть 50.0 мкл (використовуючи мікропіпетку P-200) реакційної суміші з трубки #1 в наступний новий відсік, що містить I 2 KI на тестовій пластині.
      • Не торкайтеся I2KI наконечником піпетки!
      • Ви можете продовжувати використовувати ту саму пораду для кроку 8 нижче, поки він залишається незабрудненим.
    2. Повторюйте крок 11 кожні 20 секунд, використовуючи наступний новий відсік на тестовій пластині. Продовжуйте до тих пір, поки синьо-чорний колір більше не виробляється і розчин I 2 KI не залишиться бурштиновим (вказує на те, що крохмалю не залишається). Потім порахуйте загальну кількість відсіків, які дійсно змінювали кольори плюс на те, що не змінювали кольору і помножте на 20. Запишіть час, необхідний для повного перетравлення крохмалю, в табл. 2.
    3. Якщо колір I 2 KI продовжує змінюватися на темніший колір після загальної кількості 8 хвилин тестування, припиніть тестування цієї реакційної суміші, запишіть 480 секунд як час у таблиці даних, і перейдіть до кроку 9.
    4. Повторіть кроки 9 - 13, використовуючи трубку #2, потім #3. Можливо, вам доведеться очистити тестову пластину, промивши її водою DI, постукуючи її насухо, а потім додаючи в відсіки свіжий I 2 KI.
    Таблиця даних 2

    Трубка

    Температура (o C)

    Час перетравлення крохмалю (сек)

    1

    80

    2

    37

    3

    4

    Аналіз даних

    Як би ви інтерпретували результати, наведені в таблиці 10.2?

    Навчальні питання

    1. Як фермент прискорює хімічну реакцію?
    2. Які фактори можуть денатурувати білок? Як?
    3. Яку реакцію каталізує амілаза?
    4. Поясніть колірметричний аналіз, який використовується для моніторингу активності амілази.