Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

11.4: Кількісне вимірювання нуклеїнової кислоти

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6466

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Кількісна ПЛР (qPCR)Файл: Taqman.png

    Вимірювання можуть проводитися окремих генів, що цікавлять, за допомогою ПЛР цих специфічних генів. Процес, відомий як ПЛР у реальному часі або кількісна ПЛР (qPCR), використовується для вимірювання окремих генів за допомогою вимірювань флуоресценції. Інтеркаляційний агент, який зв'язується лише з дволанцюговою ДНК під назвою Sybr Green, використовується в машині QPCR, яка вимірює флуоресценцію після кожного циклу ПЛР побічно вказує на кількість ампліфікованого продукту. Однак неспецифічні продукти посилення також можуть бути виміряні і не дискриміновані від автентичного амплікону.

    Альтернативою Sybr Green є приклад технології TaqMan. За допомогою TaqMan третій праймер (зонд TaqMan) розроблений посередині області, що підлягає посиленню. Цей середній праймер розроблений з шпилькою самодоповнюваність так, що 5′ і 3′ кінці знаходяться в безпосередній близькості. На одному кінці прикріплений флуоресцентний репортер, а інший кінцевий має гасителя, який поглинає будь-який сигнал флуоресценції. За звичайних обставин вимірювання флуоресценції будуть дуже низькими. Коли відбувається розширення ПЛР, полімераза гідролізує цей середній праймер, тим самим відокремлюючи гаситель і репортер. Назва TaqMan - це гра слів, оскільки уявляється, що полімераза пережовує зонд, як Пакман. Зі збільшенням відстані між гасителем/репортером тепер можна виміряти сигнал флуоресценції від цього зонда. Цей спосіб набагато більш специфічний, ніж Sybr Green. Однак використання конкретних зондів значно збільшує вартість.

    Порогові цикли (C t)

    Файл: QPCR-циклічний.png

    Кредит: Зузанна Філутовська (CC-BY-SA 3.0)

    Вимірювання флуоресценції на початку процесу ПЛР буде дуже низьким через невелику кількість молекул dsDNA (Sybr Green) або більшість праймерів TaqMan, які гасяться. Під час цього експоненціального виробництва ДНК буде досягнуто поріг, при якому флуоресценція буде лінійно збільшуватися. Конкретна точка, де флуоресценція чітко вимірюється, називається пороговим циклом (C t) використовується як контрольна точка для порівняння значень вираження.

    Дивлячись на приклад Sybr Green qPCR вище, можна помітити, що зразки експоненціально збільшуються при нижчому циклі (C t), мають більш високий рівень експресії мРНК (ліворуч) цього гена, ніж зразки з більшим числом циклу (праворуч). Зверніть увагу, що флуоресценція в кінцевому підсумку плато і перестає збільшуватися. Це пов'язано з виснаженням сировини для виробництва ДНК, як DNTP.

    Оскільки реакції ПЛР теоретично представляють подвоєння ДНК після кожного циклу, значення C t можна інтерпретувати за базовою системою 2. Якщо між двома зразками (ΔC t) в 5 циклів існує різниця в C t, це відповідає різниці в 2 5 або 32 рази. Ми можемо контролювати варіації препарату РНК шляхом порівняння значень флуоресценції нашого гена, що цікавить, з геном домашнього господарства, таким як актин. Використання гена домашнього господарства для нормалізації початкового введення в реакції та порівняння між зразками називається відносною кількісною оцінкою.

    Криві розплаву для Sybr Green

    Файл:Аналіз кривої плавлення Graphs.svg

    Верхня панель ілюструє зниження флуоресценції при підвищенні температури через дисоціацію дволанцюгової ДНК. Нижня панель ілюструє першу похідну ділянку. Кожен пік в цьому прикладі ілюструє різний алель. Подвійні піки представляють наявність 2 різних алелів у продуктах посилення.

    Кредит: Картопляний бізнес Шони (CC-BY-SA 3.0)

    Використовуючи Sybr Green, нам потрібно переконатися, що ПЛР є специфічною, щоб вимірювання флуоресценції дійсно відображало ампліфікацію нашого цікавить гена. В кінці кожного запуску QPCR (~40 циклів) виконується крива розплаву. Крива плавлення (або крива дисоціації) походить від постійних вимірювань при підвищенні температури. Зі збільшенням температури нитки ДНК починають денатурувати і флуоресценція почне зменшуватися. Після повного відділення ниток ДНК флуоресценція знову залишиться постійною. Спосіб розгляду цієї кривої здійснюється через похідний графік, де перегин у показаннях флуоресценції повідомляється як температура плавлення (Tm).

    крива розплаву

    Ця крива розплаву ілюструє кожен зразок містить той самий конкретний продукт з температурою плавлення 83,51° C.

    Будь-які піки в цій ділянці відносяться до конкретного продукту ПЛР. Якщо з'явиться кілька піків, результати не будуть дійсними, оскільки вони безпосередньо не вимірюють один продукт.

    Вимірювання виразів

    Диференціальна експресія генів відноситься до транскрипційних програм, активованих клітиною в різних умовах. «Диференціал» означає порівняння двох або більше станів або часових точок. Використовуючи мРНК як непряме вимірювання білка, можна встановити, які білки пов'язані з цими різними станами. У еукаріотів це можна оцінити шляхом збагачення загальної РНК для зрілої мРНК, що містить поліа. Завдяки використанню оліго- (dT), що містить смолу, мРНК можна відокремити від небілкових кодуючих РНК. Так само виконання зворотної транскрипції за допомогою оліго- (dT) праймера створить стабільну комплементарну молекулу ДНК (кДНК), яку можна використовувати з ПЛР. Використання QPCR таким чином називається RT-PCR або полімеразною ланцюговою реакцією зворотної транскрипції, де специфічні пари праймерів використовуються для посилення невеликої частини відомого гена.

    Методи та мікромасиви на основі гібридизації:

    Файл: Північний Blot.jpg

    Кредит: Заморожений Людина (CC-BY-SA 4.0)

    До проведення ЗТ-ПЛР експресію окремих генів оцінювали за допомогою підходу, заснованого на гібридизації. Цей метод викликав запуск РНК на агарозному гелі та перенесення фракціонованих за розміром РНК на мембрану за допомогою методу, який називається «промокання». Потім ця перенесена РНК була гібридизована до радіоактивно маркованого зонда для конкретного гена (відповідного зворотній комплементарній послідовності) і візуалізована шляхом впливу рентгенівської плівки в процесі, який називається Північним Блоттінгом. Інтенсивність смуги була б пропорційною кількості мРНК, що відповідає гену, що цікавить. Повторне зондування з геном домашнього господарства, як актин, буде використовуватися як контроль навантаження, щоб проілюструвати, що аналогічна кількість загальної РНК завантажується в кожну лунку. Відмінності розмірів мРНК на Північному блоті також виявили відмінності у варіантах зрощування зрілої мРНК у різних станах.

    Мікромасив

    Кредит: Джеремі Сето (CC-BY-NC-SA)

    Пізніше ця методика була адаптована з використанням нерадіоактивних методів. Використовуючи ці нерадіоактивні методи, був розроблений зворотний протокол для вимірювання декількох генних мішеней. Систематично іммобілізуючи генно-специфічні зонди на мембрану або слайд мікроскопа, можна отримати масив мішеней. У найпростішій парадигмі наявності 2 станів (контрольного або експериментального) кДНК з кожного зразка може бути використана для генерації флуоресцентної РНК, яка може гібридизуватися до іммобілізованих зондів. Використання 2 різних флуоресцентних маркерів дозволяє провести конкурентну гібридизацію на масиві, завдяки чому флуоресцентний сигнал у кожному каналі може виявити диференціальну експресію генів двох станів у 2-колірній мікромасиві.