11.2: Прокаріотична транскрипція

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6464

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Непереносимість лактози бактерій

Стандартна кінетика росту кишкової палички описується кривою. Кредит: Міхал Коморнічак (CC-BY-SA 3.0)

Глюкоза є кращим джерелом енергії клітин. Франсуа Якоб і Жак Монод прагнули зрозуміти, як бактерії приймають рішення про перемикання між різними цукрами як джерелами енергії. Якоб і Монод виявили, що якби глюкоза та лактоза були представлені як їжа для бактерій, існувала б двофазна картина росту.

Кредит: CNX OpenStax (CC-BY 4.0)

Якоб і Монод зрозуміли, що глюкоза спочатку буде використана (бажане джерело), а лактоза буде перетравлена після виснаження глюкози. Це сталося тому, що в звичайних ситуаціях бактерії не мали доступу до лактози і витрачали енергію, створюючи ферменти для її перетравлення. Фермент β-галактозидаза, який відповідає за перетравлення лактози до мономерів галактози та глюкози, буде індукований лише в умовах низької глюкози та високої лактози. Монод виявив, що коли лактоза була єдиним цукром, експресія ферменту β-галактозидази була індукована і демонструвала монофазний ріст із затримкою.

Лак Оперон

Пізніше Джейкоб і Монод виявили, що гени, що беруть участь у використанні лактози, були згруповані в близькості під координованим механізмом контролю. Це стало відомо як Лак оперон.

Схема «Лак Оперон». LacZ, LacY та LaCa транскрибуються як одна мРНК.

Використання лактози як джерела енергії віддають перевагу бактеріям, коли глюкози немає. У присутності рясної глюкози було б марною тратою енергії та клітинних ресурсів взяти на себе зобов'язання синтезувати мРНК та білок для β-галактозидази. Якщо лактоза не присутня, білок зв'язується з частиною промотора Lac, який називається оператором. Цей білок репресора кодується іншим геном (LaCi) поза генним кластером. Іноді репресор розв'язується з оператором, і РНК-полімеразі дозволяється транскрибувати ген LacZ (β-галактозидаза), ген LaCy (пермеаза) та ген LaCa (ацетилаза). Ця «негерметичність» експресії важлива, оскільки білок пермеази необхідний на поверхні клітини, щоб лактоза потрапляла в клітину, якщо вона присутня в навколишньому середовищі. Наявність лактози призводить до того, що репресор відпадає з оператора, щоб надати РНК pol доступ до ДНК. Коли глюкоза низька, білок під назвою CAP (Catabolite Activated Protein) зв'язується з промотором Lac і працює як рекрутер РНК pol. Скоординовані ефекти активації CAP та інактивації Lac Repressor дають високу транскрипцію оперону.

Кредит: G3Pro (CC-BY 2.0)

LaCi пов'язаний з 2 послідовностями операторів ДНК.

Кредит: Сократ джедаїв (CC-BY-SA 3.0)

Симуляція Lac Operon

Запустіть моделювання нижче, щоб вивчити скоординовану активацію Lac Operon.

LaCZ як репортер ген

PuC19 містить ДНК LaCZ як репортерний ген, щоб проілюструвати наявність функціонуючого гена. Транскрипція цього гена обумовлена місцем зв'язування для субодиниці РНК-полімерази під назвою σ фактор. Сайт зв'язування фактора σ визначає спрямованість РНК-полімерази, оскільки існує можливість транскрибування в 2 напрямках. Стандарт σ фактор зв'язування сайт часто позначається як -35 TTGACA... TATAAT -10 від ініціації транскрипції.

Багаторазове місце клонування всередині плазміди забезпечує зручне місце для переміщення чужорідного шматочка ДНК. Коли в цей простір не вставляється чужорідна ДНК, продукт гена LacZ β-галактозидаза є функціональним. Порушення кадру читання для цього гена також вимикає функціональний продукт від перекладу. За допомогою хімічних репортерів цілісність цього гена може бути підтверджена за допомогою ферментативної активності.

Гідроліз лактози до галактози і глюкози

Двома хімічними репортерами, які використовуються для виявлення наявності функціонуючого LACZ, є X-Gal (5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактозид-бром-4-хлор-3-індолил-β-D-галактозид) та ОНПГ (ортонітрофенол).

X-Gal (5-бром-4-хлор-3-індоліл-β-D-галактозид) дає синій колір при розщепленні β-галактозидазою

ONPG (ортонітрофенол) дає жовтий колір при розщепленні β-галактозидазою

Як і у випадку з опероном Lac, оператор буде займати LaCi (білок репресора). Цей оператор перекриває послідовності -35 & -10. Для повної активації цих генів репресор Лаку необхідно видалити шляхом зв'язування з аналогом лактози. У цьому випадку використовується хімічний IPTG (ізопропіл β-D-1-тіогалактопіранозид), оскільки він є нерозщеплюваним аналогом, який буде постійно зв'язуватися з репресором Lac.

IPTG

Синьо-білий скринінг

Синьо-білий скринінг виявляє фенотип трансформованих бактерій на основі здатності X-Gal перетворення β-лактамазою Кредит: Стефан Вальковський (CC-BY-SA 4.0)

Посилання

JACOB F, MONOD J. Генетичні регуляторні механізми в синтезі білків. J Мол Біол. 1961 чер; 3:318-56.