11.3: РНК мініпреп (активність)

Вправа: РНК мініпреп

Очищення РНК відбувається аналогічно препаратам ДНК. Використовується колонка на основі кремнію, де ДНК виключається з зв'язування залежно від розміру та через додатковий етап перетравлення ДНК з використанням ферменту ДНКАзи I. РНК надзвичайно крихка і схильна до деградації. Через це окремі піпетки та пластмаси зазвичай використовуються в лабораторіях для зменшення кількості впливу навколишнього середовища або експериментальної РНК. При роботі з РНК будьте гранично обережні з забрудненням буферів або зразків. Завжди надягайте рукавички, оскільки шкіра несе ферменти РНКази. Утримайтеся від розмов, щоб не забруднити область РНАзою, знайденою в слині.

RLT = буфер лізису РНК: містить гуанідин, суворий денатурант
RW1 = буфер для промивання РНК
RPE = Другий буфер для промивання РНК з етанолом
RDD = буфер для перетравлення ДНКАзи

1. Збирайте максимум 1 х 10 ⁷ клітин, як клітинну гранулу або шляхом прямого лізису в посудині. Додайте відповідний обсяг Buffer RLT і vortex енергійно.

• Якщо < 5 х 10 ⁶ клітин → 350 мкл RLT (пластина <6 см)
• Якщо ≤ 1 х 10 ⁷ клітин → 600 мкл RLT (пластина 6-10 см)

2. Додайте 1 об'єм 70% етанолу до лізату і добре перемішайте піпеткою. Не центрифугуйте. Приступайте відразу до наступного кроку.
3. Перенесіть до 700 мкл зразка, включаючи будь-який осад, в спіновий стовп, поміщений в збірну пробірку об'ємом 2 мл (поставляється в комплекті).
   1. Закрийте кришку і центрифугуйте протягом 15 с при ≥8000 х г.
   2. Відмовтеся від проточної.
4. Прання: Додайте 350 мкл буфера RW1 для віджиму колонки, закрийте кришку, центрифугу протягом 15 с при ≥8000 х г (≥10000 об/хв). Відмовтеся від проточної.
5. Додайте 10 мкл dNaSe I запасний розчин (див. Вище) до 70 мкл буферного RDD. Змішайте, обережно перевертаючи трубочку.
6. Видаліть ДНК (необов'язково): Додайте інкубаційну суміш dNaSe I (70 мкл) безпосередньо до мембрани спіну колонки та покладіть на стільницю (20—30° C) на 15 хвилин.
7. Промивання: Додайте 350 мкл буфера RW1, щоб відкрутити колонку, закрити кришку, центрифугу протягом 15 с при ≥8000 х г Відкинути потік.
8. Додайте 700 мкл буфера RW1 до віджимного стовпця. Закрийте кришку і центрифугуйте протягом 15 с при ≥8000 х г.
9. Додайте 500 мкл буфера RPE до стовпа спина. Закрийте кришку і центрифугуйте протягом 15 с при ≥8000 х г.
10. Додайте 500 мкл буфера RPE до стовпа спина. Закрийте кришку і центрифугуйте протягом 2 хв при ≥8000 х г.
11. Відкиньте всю проточну і центрифугу на повній швидкості протягом 1 хв, щоб висушити мембрану.
12. Помістіть стовпчик віджиму в нову пробку для збору об'ємом 1,5 мл. Додайте 30 мкл води без РНКАЗ безпосередньо до мембрани спін-колонки.
13. Закрийте кришку та центрифугуйте протягом 1 хв при ≥8000 х г для виділення РНК.
14. Додайте 30 мкл води без РНКАЗ безпосередньо до мембрани спін-колонки. Закрийте кришку та центрифугуйте протягом 1 хв при ≥8000 х г для виділення РНК.

Зворотна транскрипція

Центральна догма молекулярної біології була запропонована Френсісом Криком, співописувачем дволанцюгової спіральної структури ДНК. Ця «догма» була заявою для опису потоку генетичної інформації, щоб показати, що ДНК розміщує або зберігає дані, які транскрибуються в РНК, яка згодом перетворюється з нуклеотидів в амінокислоти через механізми рибосом. Оскільки ДНК відносно статична в своїй здатності зберігати генетичну інформацію, експресія цих збережених даних в проміжну РНК або в кінцевий білковий продукт має велике значення. Уявіть, що ДНК в ядрі ваших щокових клітин ідентична ДНК ядра клітин вашої печінки. Поки інструкції ідентичні, це явно різні клітини, які мають різницю в експресії білків. Уявіть собі жорсткий диск на комп'ютері, який зберігає інформацію як 1 і 0, Ці 1 і 0 не мають значення, поки конкретні програми не покликані діяти на цю інформацію. Так само різні програми покликані використовувати інструкції вашої ДНК, щоб зробити щокову клітину відмінною від клітини печінки.

Кредит: Даніель Горспол (CC-BY-SA 3.0)

У 1970 році Говард Темін і Девід Балтімор самостійно виділили фермент з вірусу саркоми Роза та вірусу лейкемії мишей відповідно. Цей фермент був здатний порушити Центральну Догму. Геноми цих вірусів складаються з РНК, а не з ДНК. Під час інфекційного процесу цей фермент відповідає за перетворення РНК в ДНК в процесі, який називається зворотною транскрипцією. Цей фермент логічно називається зворотною транскриптазою (RT). Це відкриття було нагороджено Нобелівською премією в 1975 році. Пізніше було виявлено більше вірусів, які складаються з геномів РНК, які використовували цей процес, включаючи ВІЛ. Інші ферменти всередині клітин також були визнані, що мають зворотну транскриптазну активність, такі як теломераза та ретротранспозони. У молекулярній біології ці ферменти використовуються для перетворення мРНК в комплементарні копії ДНК, звані кДНК. Загальна сума всього, що транскрибується в РНК, називається транскриптом. Синтез кДНК з будь-якої транскрибованої РНК може бути використаний для аналізу транскриптом.

Вправа: Зворотна транскрипція еукаріотичної мРНК

МРНК з еукаріотів модифіковані 3′ поліаденільованими хвостами. Оліго-ДТ праймери можуть бути використані для прогрунтування процесу зворотної транскрипції всіх мРНК. Всі розчини слід тримати на льоду.

1. Визначте концентрацію загальної РНК.
2. Відрегулюйте концентрацію РНК до 0,1 мг/мл, використовуючи вільну воду Rnase.
3. Об'єднати 10 мл РНК, 1 мл оліго-ДТ (50 мкм) та 1 мл DNTP Mix (10 мМ кожен).
4. Денатуруйте суміш при 65° C протягом 5 хвилин, а потім покладіть на лід.
5. З'єднайте в окремому тюбику наступне:
   1. 4 мкл Буфер 5X → містить всі солі та буфер рН
   2. 2 мкл 0,1 М ДТТ → відновник для імітації клітинного середовища
   3. 1 мкл РННК (40U/мкл) → інгібітор РНК
   4. 1мкл SuperScript III RT → фермент зворотної транскриптази
6. Після того, як денатурована суміш буде досить охолоджена, додайте 8мкл ферментної суміші.
7. Інкубувати 45°C протягом 1 години.
8. Деактивувати фермент шляхом інкубації 75° C протягом 10 хвилин.
9. Зберігайте кДНК в морозильній камері.