3.7: Кінетика ферментів із спектровісом
Кінетика ферментів пероксидази ріпи
Перекис водню (H 2 O 2) - сильний окислювач, який може пошкодити клітини і утворюється як побічний продукт споживання кисню. На щастя, аеробні клітини містять пероксидази, які розщеплюють перекис на воду і кисень. Цей фермент зменшує перекис водню в Н 2 О шляхом окислення органічної сполуки (АГ 2 -> А).
Ця вправа використовує екстракт ріпи як джерело пероксидази. Цей екстракт ріпи вимагає джерела електронів (відновника) для того, щоб реакція відбулася. При цьому використовується безбарвна органічна сполука під назвою гваякол. Гуаяколь окислюється в процесі перетворення перекису і стає коричневим. Потім ферментативну активність можна простежити за допомогою спектрофотометра для вимірювання кількості утворюється коричневого кольору.
Налаштування та калібрування LabQuest за допомогою SpectroVis Plus
- Налаштуйте кювету, щоб вона служила бланком.
- Додати 10 крапель 0,02% перекису водню.
- Додати 5 крапель 0,2% гваяколу.
- Додайте 20 крапель буфера pH 7.
- Додайте 10 крапель екстракції буферизованих.
- Підключіть LabQuest2 до SpectroVis плюс і запустіть програму збору даних.
- Калібрувати SpectroVis.
- Змінити режим.
- Виберіть «На основі часу» у випадаючому меню та натисніть OK, коли закінчите.
- Змінити режим.
- Швидкість: 0,5 пробок/с
- Інтервал: 2 с/зразок
- Тривалість: 200 s
2. Натисніть кнопку Play (зелена стрілка).
1. Виконайте розминку протягом 90 секунд.
1. Вибираємо «Завершити калібрування».
2. Натискаємо «ОК».
2. Натискаємо кнопку «Стоп» (Червона площа).
4. Виберіть «Значок лічильника» (верхній лівий більшу частину дисплея).
- Натисніть велику червону область, що показує поточне показання поглинання.
- Вибираємо «Змінити довжину хвилі».
- Встановіть довжину хвилі до 500 нм.
Вплив рН на пероксидазну активність
- Налаштування кювети на pH 3.
- Додати 10 крапель 0,02% перекису водню.
- Додати 5 крапель 0,2% гваяколу.
- Додайте 20 крапель буфера pH 3.
- Додайте 10 крапель екстракції ріпи в останню чергу.
- Швидко інвертуйте кювету і помістіть кювету в Spectrovis Plus.
- Натисніть кнопку відтворення, щоб розпочати запис даних (виберіть «відкинути дані», якщо з'явиться запит).
- Після 200s видаліть SpectroVis з USB.
- Вставте флешку і почекайте 1 хвилину.
- Натисніть Файл → Експорт → виберіть значок USB і перейменуйте файл і додайте «.csv» до кінця назви файлу.
- Натискаємо ОК.
- Послідовно повторіть експеримент, обмінюючись рН-буфером з рН 5, 7, 10.
Вплив температури на пероксидазну активність
- Налаштуйте кювету на 0ºC
- Додати 10 крапель 0,02% перекису водню (інкубують при 0ºC протягом 10 хвилин).
- Додати 5 крапель 0,2% гваяколу.
- Додайте 20 крапель буфера екстракції при 0ºC.
- Додайте 10 крапель екстракції ріпи (інкубується при 0ºC протягом 10 хвилин) в останню чергу.
- Швидко інвертуйте кювету і помістіть кювету в Spectrovis Plus.
- Натисніть кнопку відтворення, щоб розпочати запис даних (виберіть «відкинути дані», якщо з'явиться запит).
- Після 200s видаліть SpectroVis з USB.
- Вставте флешку і почекайте 1 хвилину.
- Натисніть Файл → Експорт → виберіть значок USB і перейменуйте файл і додайте «.csv» до кінця назви файлу.
- Натискаємо ОК.
- Послідовно повторіть експеримент, обмінюючись буферами, що зберігаються при 20ºC, 40ºC, 60ºC.
Вплив концентрації субстрату на пероксидазну активність
- Налаштуйте кювету для 1X субстрату.
- Додати 10 крапель 0,02% перекису водню.
- Додати 5 крапель 0,2% гваяколу.
- Додайте 20 крапель буфера екстракції.
- Додайте 10 крапель екстракції ріпи в останню чергу.
- Швидко інвертуйте кювету і помістіть кювету в Spectrovis Plus.
- Натисніть кнопку відтворення, щоб розпочати запис даних (виберіть «відкинути дані», якщо з'явиться запит).
- Після 200s видаліть SpectroVis з USB.
- Вставте флешку і почекайте 1 хвилину.
- Натисніть Файл → Експорт → виберіть значок USB і перейменуйте файл і додайте «.csv» до кінця назви файлу.
- Натискаємо ОК.
- Послідовно повторіть експеримент з різною кількістю буфера і перекису:
- Повторіть експеримент з підкладкою 0.2X і експортуйте дані на USB-накопичувач.
- Повторіть експеримент з 2X підкладкою і експортуйте дані на USB-накопичувач.
- Повторіть експеримент з підкладкою 3X і експортуйте дані на USB-накопичувач.
Вплив концентрації ферменту на пероксидазну активність
- Налаштуйте кювету для ферменту 1X.
- Додати 10 крапель 0,02% перекису водню.
- Додати 5 крапель 0,2% гваяколу.
- Додайте 20 крапель буфера екстракції.
- Додайте 10 крапель екстракції ріпи в останню чергу.
- Швидко інвертуйте кювету і помістіть кювету в Spectrovis Plus.
- Натисніть кнопку відтворення, щоб розпочати запис даних (виберіть «відкинути дані», якщо з'явиться запит).
- Після 200s видаліть SpectroVis з USB.
- Вставте флешку і почекайте 1 хвилину.
- Натисніть Файл → Експорт → виберіть значок USB і перейменуйте файл і додайте «.csv» до кінця назви файлу.
- Натискаємо ОК.
- Послідовно повторіть експеримент з різною кількістю буфера і екстракту:
- Проведіть експеримент на ферменті 1X і експортуйте дані на USB-накопичувач.
- Повторіть експеримент з ферментом 0.2X і експортуйте дані на USB-накопичувач.
- Повторіть експеримент з ферментом 2X і експортуйте дані на USB-накопичувач.
- Повторіть експеримент з ферментом 3X і експортуйте дані на USB-накопичувач.