3.6: Кінетика ферментів (активність)

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 3.5: Кількісне виявлення білків (SpectroVis Plus)
- 3.7: Кінетика ферментів із спектровісом

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Фермент

Файл: Амілаза reaction.png

Амілаза - фермент, який розщеплює амілозу (крохмаль) на молекули глюкози.

Який тест можна використовувати для вказівки на наявність крохмалю?
Які параметри вплинули б на здатність ферменту полегшувати швидкість реакції?
Яка роль ферменту в хімічній реакції і з чого він зроблений?
Який тест можна використовувати для вказівки на наявність глюкози?

слина_амілаза

Слинна амілаза виробляється в роті, де починається травлення.

панкреатична_амілаза

Підшлункова амілаза виробляється в підшлунковій залозі і надходить в дванадцятипалу кишку тонкого кишечника.

амілаза_оверлей

Накладення слинної (зеленої) і панкреатичної (чирок) молекул амілази.

Вплив температури на активність ферментів

Додайте 5 мл H ₂ O в тюбик (це БЛАНК).
Додайте 5 мл крохмалю (субстрату) в 3 окремі тюбики.
- Один на льоду (0° C), один на лавці (25° C), а один на водяній бані 40° C
Додайте по 2 краплі йоду в кожну пробірку і перемішайте: Бланк, 0° C, 25° C і 40° C.
Прочитайте Бланк у спектрофотометрі та відкалібруйте його до 100% пропускання при 560 нм.
Зчитуйте кожну трубку в спектрофотометрі. Це час 0 хвилин.
Додайте по 35 крапель розчину амілази в кожну пробірку одночасно. Змішайте і переконайтеся, що інкубація відбувається при правильній температурі.
З інтервалом в 2 хвилини швидко зчитуйте ВСІ трубки в спектрофотометрі і негайно поверніть трубки до належної температури.
Продовжуйте читати зразки кожні 2 хвилини, поки не досягнете 22 хвилин на таблиці нижче.

Час (хв)	0ºC % Транс	25ºC % Транс	40ºC % Транс
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22

Вплив рН на активність ферментів

Додайте 5 мл води в порожню тубу (це БЛАНК)
До 3 окремих пробірках додайте 2,5 мл буферного рН 3, рН 5 або рН 7
1. Додайте 2,5 мл крохмалю (субстрату) в кожну з цих тюбиків (крім BLANK)
Додайте по 2 краплі йоду в кожну пробірку і перемішайте: Blank, pH 3, pH 5, pH 7
Прочитайте Бланк у спектрофотометрі та відкалібруйте його до 100% пропускання при 560 нм
Зчитуйте кожну трубку в спектрофотометрі. Це час 0 хв.
Додати по 35 крапель розчину амілази в кожну пробірку одночасно, перемішати до однорідності.
З інтервалом в 2 хвилини швидко зчитуйте ВСІ трубки в спектрофотометрі.
Продовжуйте читати зразки кожні 2 хвилини, поки не досягнете 22 хвилин на таблиці нижче.

Час (хв)	рН 3 % Транс	рН 5 % Транс	рН 7 % Транс
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22

Вплив концентрації ферменту на активність ферментів

Додайте 5 мл води в порожню тубу (це БЛАНК)
Додайте 5 мл буфера pH 7 в 3 окремі пробірки.
Дотримуйтесь наведеної нижче схеми розведення:

розведення амілази

Схема розведення амілази (ферменту)

У 4 окремі тюбики додати 4 мл розчину крохмалю.
- Позначте їх 1x, 1/5x, 1/25x, 1/125x
Додайте 2 краплі йоду в кожну крохмальну трубку і заготовку.
Прочитайте Бланк у спектрофотометрі та відкалібруйте його до 100% пропускання при 560 нм.
Зчитуйте кожну трубку в спектрофотометрі. Це час 0 хвилин.
Додайте 35 крапель розведених розчинів амілази в відповідні марковані пробірки одночасно і перемішайте.
- Кожна трубка отримує різне розведення амілази.
З інтервалом в 2 хвилини швидко зчитуйте ВСІ трубки в спектрофотометрі.
Продовжуйте читати зразки кожні 2 хвилини, поки не досягнете 22 хвилин на таблиці нижче.

Час (хв)	1 Х % Транс	1/5 Х % Транс	1/25 Х % Транс	1/125 Х % Транс
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22

Вплив концентрації субстрату на активність ферментів

Додайте 5 мл води в порожню тубу (це БЛАНК)
Додайте 5 мл буфера pH 7 в 3 окремі пробірки
Дотримуйтесь наведеної нижче схеми розведення:

У 4 кювети ДОДАЙТЕ 4 мл розведеного крохмального розчину.
- Позначте їх 1x, 1/2x, 1/4x, 1/8x.
Додайте 2 краплі йоду в кожну крохмальну трубку і заготовку.
Прочитайте Бланк у спектрофотометрі та відкалібруйте його до 100% пропускання при 560 нм.
Зчитуйте кожну трубку в спектрофотометрі. Це час 0 хвилин.
Додати по 35 крапель розчину амілази в кожну пробірку одночасно і перемішати.
З інтервалом в 2 хвилини швидко зчитуйте ВСІ трубки в спектрофотометрі.
Продовжуйте читати зразки кожні 2 хвилини, поки не досягнете 22 хвилин на таблиці нижче.

Час (хв)	1 Х % Транс	1/2 Х % Транс	1/4 Х % Транс	1/8 Х % Транс
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22

Побудовувати результати

Використовуючи plot.ly, побудуйте дані на тій же діаграмі.
Обчисліть рядок, який найкраще підходить для кожного набору даних.
Ухил представляє активність ферменту в кожному стані. Яка одиниця цієї діяльності?