9.10: Біонеорганічна хімія платинових протипухлинних препаратів; Як вони можуть працювати? (Частина 2)
- Page ID
- 20088
6. Вплив структури ДНК на зв'язування платини
а. A-, B- і Z-ДНК 140
Як більш детально розглянуто в главі 8, двоспіральна ДНК може приймати різні поліморфні форми в залежності від умов в розчині або полікристалічному волокні. Навіть всередині даної молекули ДНК можуть існувати залежні від послідовності локальні вторинні та третинні структурні відмінності, які становлять важливі сигнали для зв'язування та обробки молекул клітинної ДНК. Вже розглянутим прикладом є розпізнавання паліндромних послідовностей за рестрикційними ендонуклеазами II типу. Як показано на малюнку 9.24, трьома такими поліморфами ДНК є правосторонні A- і B- та лівосторонні Z-форми. Найбільш часто зустрічається в розчині В-ДНК, що характеризується добре класифікованими великими і незначними борозенками, позначеними стрілками на малюнку 9.24. Мішені зв'язування платини, атоми гуаніна N7, розташовані в головній канавці.
Якою мірою залежні від послідовності локальні структурні модуляції впливають на зв'язування платини? Хоча загальної відповіді на це питання дати не можна, є кілька цікавих анекдотичних відомостей, які варто згадати. Z-ДНК, форма, яка сприяє чергуванню послідовностей пурин-піримідину, таких як у полі d (GC), не є особливо хорошою мішенню для зв'язування цис-DDP. З одного боку, йому не вистачає бажаних послідовностей d (GPG) або d (ApG). Монофункціональний [Pt (dien) CI] + комплекс, однак, полегшує конформаційний перехід B-ДНК → Z-ДНК, про що свідчать циркулярний дихроїзм та спектроскопічні дані 31 P ЯМР. 141 У Z-ДНК гуанозин нуклеозид приймає конформацію сину (рис. 9.9), що, імовірно, сприяє розміщенню громіздкого {Pt (dien)} 2+ фрагмента на N7. Більш того, локальна щільність заряду на ДНК більша в Z-, ніж В-ДНК, завдяки більш близькій близькості фосфатних груп, а перша імовірно стабілізується зарядом +2 на платиновому комплексі.
b. вплив локальної послідовності та вільних і зв'язаних інтеркаляторів на платинове зв'язування
Більший інтерес, можливо, до протипухлинних взаємодій наркотик-ДНК представляє той факт, що деякі цілі d (GpG), d (ApG) і навіть d (ГПа) для зв'язування цис-DDP дуже чутливі до послідовностей, в які вони вбудовані. Це явище було вперше виявлено під час екзонуклеази III картографічних досліджень зв'язування цисплатина з фрагментом рестрикції 165-bp з ДНК pBr322. 142 Хоча cis -DDP зв'язування зупиняє фермент при послідовностях G 3, G 5 та GAGGGGAG, при співвідношенні a (D/N) b 0,05 є мало доказів для координації з явно сприятливою послідовністю G 6 CG 2 (рис. 9.25, провулок 8). Коли платинування проводилося в присутності інтеркалятора ДНК EtDBr (рис. 9.11), однак послідовність G 6 CG 2 стала місцем зв'язування Pt (рис. 9.25, смуги 9-12). Більш широке дослідження картографування екзонуклеази III цього явища припустило, що послідовності, що містять d (CGG), загалом менш добре платиновані цис-DDP. 143,144 Крім того, тільки EtDBr, а не інші інтеркалатори типу акридину або фенантридинію, зміг сприяти виявленому ферментом цис-DDP зв'язування з цими послідовностями. Пропоноване пояснення цих результатів полягає в тому, що локальні послідовності d (PurCgG) можуть мати структуру А-ДНК-типу (рис. 9.24), в якій основна канавка вузька, що гальмує доступ платини до N7 гуанозиннуклеозидів. При наявності інтеркалятора EtDBR локальна структура ДНК може бути змінена таким чином, щоб дозволити зв'язування. 143 144
Відповідно до цієї інтерпретації та подальшого окреслення можливої причини, чому акридини та деаміновані катіони етидію не сприяють зв'язуванню цисплатину з послідовностями d (PurCGG), були проведені дослідження ЯМР, які виявили середній час перебування EtDBr на ДНК, щоб бути в 6-21 разів довше, ніж у будь-якого з інші інтеркалатори обстежуються. 144 Таким чином, для цих останніх інтеркалаторів місцева структура ДНК, імовірно, може розслабитися назад до тієї, яка не сприяє зв'язуванню цисплатину, перш ніж вона може дифузувати на місці. Більше того, коли акридин помаранчевий (AO), один з п'яти досліджуваних інтеркалаторів, який не сприяє зв'язуванню цисплатину з виключеними ділянками, був ковалентно прикріплений до дихлоретилендіамінплатини (ll) (рис. 9.26) через ланцюг гексаметиленового компоновки, отримана молекула Ao-PT змогла зв'язуватися з усіма сайтами d (CpgPG), як визначено за допомогою екзонуклеази III картографування. У прив'язаній молекулі висока локальна концентрація поблизу місця зв'язування інтеркалатора полегшує приєднання фрагмента {Pt (en)} 2+ до ДНК до того, як фрагмент акридинового апельсина може розсіюватися і структура може розслабитися, щоб реформувати виключену ділянку.
Згодом виключене явище сайту було виявлено для зв'язування цис-DDP, як оцінюється активністю 3'-5'-екзонуклеази Т4 ДНК-полімерази. 145 сайтів зупинки ферментів спостерігалися на всіх послідовностях d (GpG), але лише слабо, коли на місці d (GTGGTC). Аналогічно, daPG не моделювався при вбудовуванні в послідовності PygaCpy та PygagCA. Хоча більшість послідовностей d (ГПа) не були платинові, як виявлено картографуванням T4, деякі з них були. Ці результати ще більше підкреслюють важливість локальної послідовності модуляції цисзв'язування з ДНК.
c ДНК-сприяння хімії реакцій
У ETDBR-посиленому зв'язуванні цис-DDP з ДНК невелика частка (< 5 відсотків) інтеркалятора сильно пов'язана і може бути діалізована лише дуже повільно. 145 Встановлено детальну структуру цього потрійного комплексу ДНК-цисплатин-ETDBR, який передбачає зв'язування cis - {Pt (NH 3) 2} 2+ з екзоциклічними аміногрупами етидію, а також з донорськими ділянками на ДНК. 146 Це призначення було доведено синтезом комплексів cis - [Pt (NH 3) 2 CetD) CI] 2+ в розчині диметилформаміду і подальшим дозволом їм вступати в реакцію з ДНК. Оптичні спектри одержуваних аддуктів були ідентичні спектрам потрійного комплексу. Реакції цис-DDP, і ДНК на формування потрійного комплексу сприяє сприятлива орієнтація екзоциклічної аміногрупи інтеркальованих Етд щодо координаційної площини зв'язаних з подвійною спіраллю. Екзоциклічна аміногрупа N-8 етидію, зв'язана інтеркально на ділянці, прилеглому до координованого з пурином N-7 cis - {Pt (NH 3) 2 CI} +, розташована над атомом платини в структурі, що нагадує перехідний стан для квадратно-площинного реакція заміщення. Структура цього перехідного стану була змодельована в розрахунку молекулярної механіки (рис. 9.27 Див. Розділ кольорової пластини, стор. С-16.) , 147 і отримані докази, які вказують на селективне зв'язування платини з амінопозицією Etd N-8. 148
Оскільки цисплатин зазвичай вводять у комбінованій хіміотерапії з іншими препаратами, багато з яких містять інтеркаляційні функції, сильні ковалентні, спричинені ДНК-взаємодії між молекулами ліків на цільовому місці повинні розглядатися як можливо відповідні молекулярному механізму дії. У такій ситуації повинна бути сильна перевага зв'язування обох молекул ліків для одних і тих же цільових послідовностей, оскільки лише за ознаками ймовірності малоймовірно, що обидва будуть мігрувати на один і той же ділянку шляхом випадкової дифузії при низьких концентраціях, виявлених in vivo.
d. вплив функції ДНК на зв'язування платини
Хоча про цю тему цисплатину ще мало відомо, варто зазначити, що інші препарати, орієнтовані на ДНК, такі як біфункціональні алкілуючі агенти, переважно зв'язуються з генами, які активно транскрибуються. Тому можливо, що платина проявляє такі переваги, наприклад, до одноланцюгової ДНК на транскрипційній вилці або поза нею, порівняно з дуплексною ДНК у структурах хроматину. Або, можливо, він теж зв'язується вибірково з активно транскрибується ДНК. Дослідження цих можливостей здається доцільним.
7. Спекуляції про молекулярний механізм
а Чи існує єдиний механізм?
Більшість дослідників зараз сходяться на думці, що ДНК є цитотоксичною мішенню цисплатину. Ми бачили, що препарат пригнічує реплікацію ДНК шляхом зв'язування з шаблоном і припинення процессивної дії ДНК-полімерази. Менш добре вивчено інгібування транскрипції аддуктами платинової ДНК, але останні дані чітко вказують на те, що вони можуть це зробити. Дослідження впливу платини на клітини, що ростуть в культурі, показують, що реплікація ДНК і ріст клітин можуть тривати без поділу клітин при наявності низьких рівнів (1\(\mu\) г/мл) цис-DDP-клітин, арештованих на фазі G2, стадії росту клітин якраз передує поділу. 105 арешт G2 був оборотним, але при більш високих рівнях цисплатину (8\(\mu\) г/мл) сталася загибель клітин. Ці спостереження призвели до припущення, що, можливо, відновлення ДНК після реплікації може впоратися з токсичністю, пов'язаною з пошкодженим платиною шаблоном, принаймні для синтезу ДНК, але що не існує відомого шляху, за допомогою якого транскрипція може обійти ураження pt-ДНК. Можливо, гальмування транскрипції в кінцевому рахунку є більш смертельною подією, ніж гальмування реплікації. Ця ідея суперечить усталеному факту, що на включення тимідину в ДНК більше впливає низький рівень цисплатину, ніж на включення уридину до РНК. Чи може бути більше одного біохімічного шляху, за допомогою якого цисплатин проявляє свою протиракову активність? Подальша робота необхідна для вирішення цього інтригуючого питання.
б Чи є «критичне ураження»?
Тепер ми маємо відмінне розуміння основних аддуктів ДНК, зроблених cis -DDP, їх структури та відповідні спотворення ДНК. Інформація про аддукти, виготовлені неактивним транс-ізомером, хоча і не настільки повна, також є суттєвою. У період накопичення цих знань було цікаво дізнатися, чи може «критичне ураження», специфічний аддукт ДНК з унікальною молекулярною структурою відповідальним за протипухлинну активність препарату. В даний час виявляється, що всі бідентатні аддукти, виготовлені цис - і транс-DDP, можуть пригнічувати реплікацію, хоча вони можуть бути не однаково ефективними при цьому. 149 Навіть монофункціональні аддукти виду, утворені цис - [Pt (NH 3) 2 (4-Br-Py) CI] + можуть блокувати реплікацію. 96 Таким чином, краще подумати про поняття «критичне ураження» у функціональному сенсі, де темпи утворення аддуктів, видалення та інгібування ферментів разом визначають, яке сімейство аддуктів буде проявляти протипухлинну активність, а які - ні. Тут біохімія клітини-господаря також буде важливим детермінантом. Зрозуміло, що для розмежування цих можливостей потрібно більше досліджень.
c Реплікація та відновлення в пухлинній клітині 150
Якщо протипухлинна активність цисплатина виникає з пошкоджених шаблонів ДНК, то препарат може бути вибірково токсичним для раку порівняно з нормальними клітинами тієї ж тканини, якщо відновлення пошкодження ДНК відбувалося більш ефективно в останніх. Найкращим способом вивчення цього явища було б виміряти рівні платина-ДНК та перерахувати спектр аддуктів, що утворюються в пухлині, проти нормальної біопсійної тканини, отриманої від пацієнтів, які проходять хіміотерапію цисплатином. Як описано раніше, методології зараз досягають того моменту, коли такі експерименти можуть бути проведені з метою перевірки ключових гіпотез про механізм дії цисплатину. Крім того, останнім часом були розроблені потужні нові методи для скринінгу ДНК bmdlnlnlg білків. Якби можна було ідентифікувати білки, які вибірково зв'язуються з цис-DDP-платинованою ДНК та визначити функцію, подальше розуміння явищ клітинної реплікації та відновлення. Такі клітинні фактори, які вибірково зв'язуються з ДНК, що містить аддукти цисплатину, насправді, були виявлені недавно. 107 Експерименти, які привели до цієї знахідки, та їх можливі наслідки для молекулярного механізму цисплатину описані в наступному розділі.
d. структурно-специфічні (або пошкодження) розпізнавання білки 150
Якщо селективна репарація аддуктів платини ДНК в клітині різного походження є невід'ємною частиною протипухлинного механізму цис-DDP, то важливо виявити кульулярні фактори, пов'язані з цим явищем. У бактерій цис-DDP аддукти на ДНК видаляються шляхом видалення репарації - процесу, при якому ураження спочатку ідентифікується, а потім висічується ексцинуклеазною системою UvRaBC. 151 У цьому процесі білок uVRa спочатку зв'язується з аддукційною ДНК. Згодом білки UVRB і C січуть пошкоджену пасмо, які додаткові клітинні білки відновлюють, копіюючи генетичну інформацію з залишилася пасма.
Ремонт цис-DDP внутрішньониткових зшивних зв'язків в клітині ссавців набагато менш добре вивчений. За припущенням, що аналог білка uVRa може існувати в таких клітині, були проведені експерименти, щоб спробувати виділити і клонувати ген для такого білка. Зокрема, виявлено, що рухливість платинованих фрагментів рестрикції ДНК певної довжини суттєво затримується в гелі електрофорезу після інкубаційних екстрактів з клітин HelA людини. 107 Цей зсув рухливості гелю пояснювався зв'язуванням факторів під назвою «білки розпізнавання пошкоджень» (або ДРП). Подальші дослідження з спеціально платинованими олігонуклеотидами (див. V.D.8) показали, що цисплатин ДРП специфічно зв'язується з ДНК, що містить внутрішньопрядний цис - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}] або cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PaPg)}] зшивання. При паралельній роботі ген, кодуючий для ДРП, був клонований 152 і використовувався для демонстрації виникнення такого майже у всіх еукаріотичних клітинок. Оскільки зв'язування DRP з платинованою ДНК не є специфічним для амінових лігандів, протилежних зшитим нуклеобазам, взаємодія, як вважають, передбачає розпізнавання локальних змін у скручуванні та вигині подвійної спіралі. На малюнку 9.28 зображена одна можлива структура для комплексу, утвореного між цис-DDP платинованою ДНК і ДРП. Зовсім недавно було виявлено, що клоновані білки містять білкову коробку групи високої рухливості (HMG), і навіть сам HMG 1 зв'язується з модифікованою цисплатином ДНК. 152 Клас білків був перейменований в «структуроспецифічні білки розпізнавання» (SSRP).
Відкриття SSRP, які зв'язуються конкретно з модифікованою цисплатином ДНК, викликає кілька питань, які є суб'єктами сучасного дослідження. Перший полягає в тому, щоб визначити, чи є білки невід'ємним компонентом в механізмі дії препарату. Хоча ще не вдалося індукувати білки, обробляючи клітини цисплатином, а також не було виявлено підвищених або пригнічених рівнів у клітині, стійких до платини, делеція гена SSRP в дріжджах має повторно (~ enltlv) дозволив мутантний штам менш чутливий до цисплатин, ніж клітини дикого типу. 153 Цей результат пов'язує дріжджовий SSRP з клітинною сенсибілізацією до препарату. Такий білок міг сприяти молекулярному механізму одним з декількох способів (рис. 9.28). Це може бути аналог uVRA, який, як уже згадувалося вище, розпізнає пошкодження і сигналізує клітині про проведення видалення. Якщо так, то хотілося б пригнічувати рівень білка в ракових клітині, щоб зробити їх більш чутливими до препарату. Друга можливість полягає в тому, що справжня роль SSRP полягає в тому, щоб служити активатором пухлино-клітин, і що ураження цисплатином титрують його від функціонально активних ділянок на ДНК. Як варіант, зв'язування білка може захистити цисплатинові аддукти від відновлення, зберігаючи їх летальність в момент поділу клітин і приводячи до зупинки росту пухлини. Ця остання гіпотеза вимагатиме більшої кількості SSRP у клітині, чутливих до препарату. В даний час ведуться дослідження, щоб окреслити ці три та інші гіпотези, і дізнатися, чи відкриття SSRP провістило заключну главу в пошуках молекулярного механізму цисплатину або просто було цікавою стороною.
е Стійкість до наркотиків: що ми знаємо? 150
Мабуть, найсерйознішою проблемою для успішної хіміотерапії пухлин є лікарська стійкість. 102 У більшості пухлин існує субпопуляція клітин, які природно стійкі до даного препарату; оскільки чутливі клітини вбиваються, ці рефрактерні клони беруть на себе. Крім того, резистентність може бути придбана пухлинними клітинами після багаторазового застосування препарату. Тому спроби визначити механізми, що відповідають за резистентність до цисплатину, були об'єктами значної дослідницької діяльності. Інші речовини, що пошкоджують ДНК, іноді підсилюють гени як механізм лікарської резистентності. Прикладом може служити явище резистентності до кількох лікарських засобів, при якому ген, закодований для P-глікопротеїну, посилюється в клітині, стійких до таких агентів, як дауноміцин. Вважається, що цей білок збільшує відтік препарату через клітинну мембрану за допомогою ATP-залежного від енергії насоса. В даний час ведеться інтенсивний пошук, щоб з'ясувати, чи має явище резистентності до цисплатину генетичне походження. Якби ген резистентності до цисплатину можна було клонувати та ідентифікувати його фенотип, буде відкритий потужний новий шлях подолання стійкості до наркотиків.