9.9: Біонеорганічна хімія платинових протипухлинних препаратів - як вони можуть працювати?
- Page ID
- 20064
Матеріал цього розділу становить основну частину цієї глави. Однією з важливих цілей дискусії є проілюструвати за допомогою поглибленого аналізу однієї історії випадку питання, які необхідно вирішити для з'ясування молекулярного механізму неорганічного фармацевтичного препарату. Інший - ввести прийоми, які потрібні для відповіді на ці питання, принаймні для обраного випадку. Неорганічний хімік, читаючи цей матеріал з невеликим біологічним фоном або без нього, може виявити досвід складним, хоча була зроблена спроба пояснити незнайомі терміни якомога більше. Настійно рекомендується прочитати матеріал у розділі 8 перед цим розділом. Ближче до кінця цього розділу отримані результати використовуються для спекуляції про молекулярний механізм обліку біологічної активності препарату. Розмежовуються експерименти, спрямовані на оцінку різних гіпотез. Після того, як механізм або механізми будуть відомі, слід створити нові та кращі протипухлинні препарати, які, в разі успіху, були б остаточним доказом обґрунтованості гіпотез. Ця тема розглядається в наступному і заключному розділі глави. Такий аналіз може, в принципі, бути застосований для зондування молекулярних механізмів інших металів, використовуваних в медицині, описаних раніше. Насправді, можна сподіватися, що цей підхід виявиться цінним для студентів та дослідників у цих інших областях, де набагато менше інформації в даний час доступно на молекулярному рівні.
Матеріал в цьому розділі був організований наступним чином. Спочатку обговоримо відповідну неорганічну хімію комплексів платини в біологічних середовищах. Далі ми підсумуємо докази того, що ДНК є основною мішенню цисплатину в раковій клітині, відповідальної за її протипухлинну активність. Потім описуються хімічні, фізичні та біологічні наслідки пошкодження ДНК препаратом, а потім презентація методологій, що використовуються для відображення місць її зв'язування на ДНК. Потім обговорюються детальні структури аддуктів ДНК як активних, так і неактивних платинових комплексів разом із способом, яким третинна структура подвійної спіралі може модулювати ці структури. Нарешті, представлена відповідь клітинних білків на пошкоджену цисплатином ДНК, що призводить в кінцевому підсумку до гіпотез про те, як пухлинні клітини вибірково руйнуються препаратом. Разом ці події складають наше знання про «молекулярний механізм», принаймні так, як це зараз розуміється.
1. Реакції цис-DDP та споріднених сполук у водних, біологічних та інших середовищах
цис -діамміндіхлорплатина (II) являє собою квадратно-плоский комплекс d 8. Таким чином, він належить до класу сполук, широко досліджених хіміками-координаторами. 55 Зазвичай такі сполуки є відносно інертними кінетично, зазвичай не розширюють свої координаційні числа і проходять реакції заміщення лігандів двома незалежними шляхами із законом швидкості, заданого рівнянням (9.4). Константи швидкості k 1 та k 2 відповідають шляхам першого порядку (за допомогою розчинника) та другого порядку (бімолекулярний);
\[Rate = (k_{1} + k_{2}[Y]) [complex] \tag{9.4}\]
[Y] - концентрація вхідного ліганду. Зазвичай k 1 < < k 2 на кілька порядків. Однак у біологічних рідинях концентрація потенційної молекули-мішені може становити ~ 10 -6 М, в цьому випадку k 1\(\simeq\) k 2 [Y]. Тому заміщення лігандів у цис-DDP, необхідному для зв'язування з молекулою клітинної мішені, ймовірно, буде протікати шляхом за допомогою розчинника. Такий шлях передбачається в подальшому обговоренні.
Для гідролізу першого хлоридного іона з цис - або транс-DDP,
\[[Pt(NH_{3})_{2}Cl_{2}] + H_{2}O \rightleftharpoons [Pt(NH_{3})_{2}Cl(OH_{2})]^{+} + Cl^{-} \tag{9.5}\]
значення k 1 при 25° C складають 2,5 х 10 -5 і 9,8 х 10 -5 с -1 відповідно. 55 Ці гідролізовані комплекси можуть піддаватися подальшим рівноважним реакціям, узагальненим рівняннями (9.6) до (9.9).
\[[Pt(NH_{3})_{2}Cl(OH_{2})]^{+} \rightleftharpoons [Pt(NH_{3})_{2}Cl(OH)] + H^{+} \tag{9.6}\]
\[[Pt(NH_{3})_{2}Cl(OH_{2})]^{+} + H_{2}O \rightleftharpoons [Pt(NH_{3})_{2}(OH_{2})_{2}]^{2+} + Cl^{-} \tag{9.7}\]
\[[Pt(NH_{3})_{2}(OH_{2})_{2}]^{2+} \rightleftharpoons [Pt(NH_{3})_{2}(OH_{2})(OH)]^{+} + H^{+} \tag{9.8}\]
\[[Pt(NH_{3})_{2}(OH_{2})(OH)]^{+} \rightleftharpoons [Pt(NH_{3})_{2}(OH)_{2}] + H^{+} \tag{9.9}\]
Також може відбуватися утворення димерів, таких як [Pt (NH 3) 2 (OH)] 2 2+ і вище олігомери, 56,57, але такі реакції навряд чи будуть важливими при низьких концентраціях платини, що зустрічаються в біологічних середовищах, Реакції (9.5) до (9.9), які залежать від рН і хлорид-іонних концентрацій, слідували 195 Pt (I =\(\frac{1}{2}\), 34,4 відсотка достатку) і 15 N (з використанням збагачених сполук) ЯМР спектроскопія. Останній спосіб виявив для цис-діаммінних комплексів pK значення 6,70 ± 0,10 при 25 °С для реакції (9,6) та 5,95 ± 0,1 та 7,85 ± 0,1 при 5 °С для реакцій (9,8) та (9,9) відповідно. 58
Вплив концентрації pH та Cl - іонів на видовий розподіл сполук платини було використано для формування наступного правдоподібного аргументу для хімії цис-DDP in vivo. 59 З використанням термодинамічних даних для аналога етилендіаміну (en) [Pt (en) Cl 2] оцінювали відносні концентрації гідролізованих видів при рН 7,4 (див. Таблицю 9.3) для плазми крові та цитоплазми (рис. 9.7). Більш висока концентрація іонів хлориду в плазмі зберігає комплекс у вигляді нейтральної молекули Cis-DDP, яка пасивно дифундує по клітинних мембранах. Нижня внутрішньоклітинна концентрація іонів хлориду полегшує реакції гідролізу, такі як Рівняння (9,5) до (9,9), тим самим активуючи препарат для зв'язування з його біологічними молекулами-мішенями. Існує, звичайно, розумна ймовірність того, що cis -DDP і види, отримані з нього, зіткнуться з невеликими молекулами і макромолекулами in vivo, які відводять його від цього шляху до мети. Такі випадки ми вже бачили; цисплатин зв'язується з білками сироватки крові, і є вагомі докази того, що внутрішньоклітинні тіоли вступають в реакцію з препаратом. 60 Глутатіон, наприклад, присутній в мілімолярних концентраціях в клітині. Як, можна запитати, цисплатин пропливає через таке море донорів сірки, щоб знайти свою ціль у пухлинній клітині? Чи можливо, що модифікована форма препарату, в якій зв'язок Pt-Ci був витіснений тіолатом для формування зв'язку Pt-S, є фактичним видом, відповідальним за його діяльність? Хоча на ці питання ще не надано задовільної відповіді, є підстави вважати, що подібні реакції не беруть безпосередньої участі в молекулярному механізмі дії. Як видно з досліджень взаємозв'язків між структурою та діяльністю, найбільш активні сполуки мають два лабільних ліганди в позиціях cis. Якби були потрібні облігації Pt-S, то сполуки, які вже мають такі зв'язки, як очікується, виявлятимуть активність, а вони цього не роблять. Швидше за все, здається найбільш імовірним, що протипухлинна активність цисплатину є результатом вижили видів, написаних у Рівняннях (9.5) до (9.9), які знаходять свій шлях до молекули-мішені, і що індукована токсичність повинна виникнути внаслідок значно руйнівного структурного наслідку зв'язування наркотиків. Оскільки активні тільки цис-комплекси, хімік-координатор розумно зробити висновок, що стереохімія цієї взаємодії має принципове значення.
Таблиця 9.3 - Розподіл різних аддуктів, що утворюються між цис-DDP або [3 H] [Pt (en) Cl 2] a і ДНК in vitro і in vivo. 118-122
| Співвідношення D/N | Загальний час інкубації | Аддукти
цис - [pTA 2 {d (pgPgL}] б |
цис - [pTA 2 {d (ПаПГ}] б |
Сформований
цис - [pTA 2 {d (GMP)} 2] б |
Монофункціональні Adducts | Залишилася платина c |
|---|---|---|---|---|---|---|
| in vitro | ||||||
| 0,055 см | 5 год (50 °C) | 47-50% | 23-28% | 8-10% | 2-3% | 10% |
| 0,022 д | 5 год (50 °C) | 60-65% | 20% | ~ 4% | ~ 2% | 9-14% |
| 0,01 е | 16 год (37 °C) | 62% | 21% | 7% | — | 10% |
| еф | 30 м (37 °C) | 36% | 3% | 8% | 40% | 13% |
| еф | 2 год (37 °C) | 54% | 9% | 9% | 14% | 14% |
| еф | 3 год (37 °C) | 57% | 15% | 9% | 4% | 15% |
| In vivo | ||||||
| собачий | 1 год (37 °C) | 35,9 ± 4,7% год | < 34% в | 3,1 ± 1,6% ч | 38,5% у | ~ 22% |
| собачий | 25 год (37 °C) | 46,6 ± 6,8% год | < 48% i | 3,0 ± 0,9% год | < 14,5% в | ~ 50% |
Реакції сполук платини з компонентами в середовищах, що використовуються для їх розчинення, можуть дати і, безсумнівно, породили оманливі результати, як в фундаментальній механістичній роботі, так і в скринінгових дослідженнях. Особливо примітним прикладом є диметилсульфоксид (ДМСО), який ще недавно використовувався для розчинення сполук платини, імовірно, завдяки їх більшій розчинності в ДМСО порівняно з водою. Як показала ЯМР-спектроскопія 195 Пт, цис - і транс-DDP швидко реагують (t 1/2 = 60 і 8 хв при 37° C відповідно) з утворенням [Pt (NH 3) 2 CI (DMSO)] + комплексів з хімічною та біологічною реакційною здатністю різної з тих, що мають батьківські галогеніди аміну. 61
2. Докази того, що ДНК є мішенню
Два ранніх набори експериментів вказували на взаємодію цисплатину з ДНК, а не багатьох інших можливих клітинних рецепторів, як важливу мішень, відповідальну за цитотоксичність та протипухлинні властивості. 62,63 Моніторинг поглинання радіомаркованих попередників для синтезу ДНК, РНК та білків показав, що на включення [3 H] тимідину найбільше впливали терапевтичні рівні цисплатину як для клітин культури, так і для клітин асциту Ерліха у мишей. Оскільки незалежні дослідження показали, що зв'язування цис-DDP з ДНК-полімеразою не змінює його здатності синтезувати ДНК, було зроблено висновок, що платинування шаблону, а не ферменту відповідає за інгібування реплікації.
У другому виді експерименту, що демонструє, що ДНК є мішенню цисплатину, гідролізовані форми препарату в низьких концентраціях були додані до штаму клітин E. coli K12, що містять статевий фактор F. 64,65 Після видалення вільної платини ці F+ клітини були кон'югований зі штамом клітин E. coli K12 без цього фактора, який раніше був заражений лямбда-бактеріофагом. Додавання цис-DDP, але не транс-DDP, безпосередньо до останніх інфікованих F - клітин було показано в окремому дослідженні для прискорення лізису клітин. Кон'югація з обробленими платиною F + клітинами виробляла той же ефект, настійно припускаючи, що Pt був перенесений з F + в F - клітини. Оскільки між F + і F - штамами передається тільки ДНК, було зроблено висновок, що Pt прикріплений до ДНК і що ця модифікація була важливою для спостережуваного лізису клітини. Подальші дослідження показали хорошу кореляцію між лізисом клітин сполуками платини та їх протипухлинними властивостями.
Різні інші спостереження узгоджуються з уявленням про те, що зв'язування платини з ДНК в клітині є подією біологічного наслідку. 66 Ниткоподібний ріст бактерій, що спостерігався в оригінальному експерименті Розенберга, є одним з таких доказів, оскільки інші відомі агенти, що пошкоджують ДНК, наприклад, алкілуючі препарати та рентгенівське опромінення, також викликають цю відповідь. Інша - більша чутливість до цис-DDP клітин з дефіцитом їх здатності відновлювати ДНК. Нарешті, кількісне визначення кількості платини, пов'язаної з ДНК, РНК та білками, показало, що, хоча більше Pt було пов'язано з РНК на грам біомолекули, набагато більше Pt було на ДНК при експресії як на основі молекули. За відсутності будь-якої селективної взаємодії Pt з певною молекулою лише одна з кожних 1500 білкових молекул (середній MW ~ 60 кДа) в клітині буде містити єдиний зв'язаний атом платини, тоді як сотні або тисячі атомів Pt узгоджені з ДНК (MW ~ 10 11). Якщо апарат реплікації не зможе обійти ці ураження, то поділ клітин не відбудеться, а ріст пухлини гальмується.
Хоча ці та інші результати вказують на ДНК як важливу клітинну мішень цисплатину, швидше за все, відповідальну за його протипухлинну активність, ця інформація не пояснює, чому пухлинні клітини більше уражаються цис-DDP, ніж непухлинні клітини тієї ж тканини. Більш того, чому транс-DDP, який також потрапляє в клітини, зв'язує ДНК і пригнічує реплікацію, хоча і в набагато більш високих дозах (див. Обговорення нижче), не є активним протипухлинним препаратом? Що призводить до того, що цисплатин вбиває клітини, а не просто зупиняє ріст пухлини? Останнє можна пояснити пригніченням синтезу ДНК, але не обов'язково першим. Зовсім недавні дослідження почали вирішувати ці питання, використовуючи нові потужні методології молекулярної та клітинної біології, як описано в наступних розділах цієї глави. Результати, хоча і попередні, продовжують вказувати на ДНК як найважливішу клітинну мішень цисплатину.