5.6: Монооксигенази

Відомі ферменти, що містять метали монооксигенази, які містять гемове залізо, негемове залізо або мідь на своїх активних ділянках. ² Для більшості цих ферментів існує лише обмежена інформація про характер активної ділянки і режимі взаємодії з диоксигеном або субстратами. Але є три ферменти монооксигенази, які сильно нагадують добре охарактеризовані оборотні діоксиген-несучі білки (див. Попередній розділ), припускаючи, що зв'язування диоксигену з металоензимом у відновленому стані є важливим першим кроком ферментативних механізмів, імовірно, за ним слідують інші кроки. які призводять до оксигенації субстратів. До ферментів відносяться:

1. цитохром Р-450, ⁷³ гемосодержащий білок, активний сайт якого багато в чому нагадує діоксигензв'язуючі ділянки міоглобіну або гемоглобіну, за винятком того, що осьовий ліганд до заліза - це тіолатний бічний ланцюг з цистеїну, а не бічний ланцюг імідазолу з гістидину;
2. тирозиназа, ⁷⁴, яка містить два іони міді в безпосередній близькості у своєму активному місці і яка має дезокси, окси-та зустрінуті стани, які за своїми спектроскопічними властивостями дуже нагадують порівнянні стани гемоціаніну; і
3. метан монооксигеназа, ^75,76, яка містить два негемових іони заліза в безпосередній близькості і яка нагадує гемеритрин за багатьма своїми спектроскопічними властивостями.

На додаток до цих трьох, існують також ферменти монооксигенази, що містять поодинокі негемові заліза ⁷⁷ або іони міді, ⁷⁸ або негемове залізо плюс органічний кофактор, такий як знижений птерин на їх активних ділянках. ⁷⁹ Так само, як і з ферментами диоксигенази, ми не знаємо, наскільки схожі механізми різних ферментів монооксигенази, що містять метал, один з одним. Фермент, про який ми маємо найбільше інформації, - це цитохром P-450, і тому ми зосередимо нашу дискусію на цій системі. Спекуляції про механізми для інших систем розглядаються в кінці цього розділу.

1. Цитохром Р-450

Ферменти цитохрому Р-450 - це група ферментів монооксигенази, які насичують киснем найрізноманітніші субстрати. ⁷³ Прикладами таких реакцій є:

1. гідроксилювання аліфатичних сполук (Реакція 5,59);
2. гідроксилювання ароматичних кілець (Реакція 5,60);
3. епоксидування олефінів (Реакція 5.61);
4. окислення аміну до оксидів аміну (Реакція 5,62);
5. сульфідне окислення до сульфоксидів (Реакція 5.63); і
6. окислювальне деалкілювання гетероатомів (наприклад, Reaction 5.64).

\(\tag{5.59}\)

\(\tag{5.60}\)

\(\tag{5.61}\)

\(\tag{5.62}\)

\(\tag{5.63}\)

\[Ph—O-CH_{3} \longrightarrow Ph—OH + HCHO \tag{5.64}\]

Деякі з цих реакцій мають велике фізіологічне значення, оскільки вони являють собою ключові перетворення в обміні речовин, як, наприклад, в ліпідному обміні та біосинтезі кортикостероїдів. ⁷³ Цитохром Р-450 також відомий каталізує перетворення певних преканцерогенів, таких як бензопірен, в їх канцерогенні форми. ⁷³

Багато ферментів P-450 важко охарактеризувати, оскільки вони пов'язані з мембранами і, отже, відносно нерозчинні у водному розчині. Однак цитохром P-450 _{кулачок}, який є компонентом камфорної 5-монооксигеназної системи, виділеної з бактерії Pseudomonas putida, розчинний і був особливо корисним як предмет численних спектроскопічних і механістичних досліджень, а також декількох рентгенівських визначення кристалографічної структури. ⁸⁰ Цей фермент складається з одного поліпептидного ланцюга, переважно\(\alpha\) -спірального, з групою гема b (Fe-протопорфірин IX), затиснутою між двома спіралями, без ковалентних вкладень між порфіриновим кільцем і білком. Один осьовий ліганд, що складається з заліза, є цистеїнілтіолат. У стані спокою залізо переважно з низьким віджимом Fe ^Li, ймовірно, з водою, як і інший осьовий ліганд. Коли субстрат зв'язується з ферментом спокою, стан спина змінюється на високий спін, а нецистеїновий осьовий ліганд зміщується. Фермент може бути зведений до стану Fe ^II, який є високим спіном, і нагадує дезоксигемоглобін або міоглобін у багатьох своїх спектроскопічних властивостях. Ця форма заліза зв'язує диоксиген, утворюючи оксигенну форму або окис вуглецю, щоб зробити карбонільну форму. Похідна СО має смугу Сорета (високоенергетичний\(\pi\) -\(\pi\) * перехід порфіринового кільця) при 450 нм, незвично низьку енергію для карбонільного похідного гемового білка через присутність осьового тіолатного ліганда. Ця спектроскопічна особливість допомагає у виділенні ферменту і відповідає за його назву.

а. «Активний кисень»

Камфорна 5-монооксигеназа являє собою трикомпонентну систему, що складається з цитохрому Р-450 _{кулачка} і двох електронно-переносних білків, флавопротеїну і залізо-сірчаного білка (див. Глави 6 і 7). Роль електронно-переносних білків полягає в доставці електронів до ферменту P-450, але вони можуть бути замінені in vitro іншими відновниками. Послідовність реакції - на малюнку 5.10.

Малюнок 5.10 - Запропонований механізм для цитохрому Р-450. Фермент спокою показаний у верхній частині циклу. Субстрат зв'язується з ферментом в положенні, близькому до центру заліза, але він безпосередньо не узгоджується з іоном металу. Потім ферментно-субстратний комплекс відновлюють до двовалентної форми. Потім диоксиген зв'язується, утворюючи окси-комплекс (не показано). Потім окси-комплекс відновлюється іншим електроном і протонується, даючи залізо-гідропероксидний комплекс, показаний на дні циклу. Ліганд, пов'язаний тут до центру Fe ^III, є HO ₂ ^-, тобто депротонована перекис водню. Потім гідропероксидна форма ферментно-субстратного комплексу піддається гетеролітичному розщепленню O—O зв'язку, даючи високовалентний оксоцентр Fe ^IV, при цьому ліганд порфірину окислюється одним еквівалентом (див. Текст). Потім цей вид переносить нейтральний атом кисню до пов'язаного субстрату, який потім вивільняється, даючи оксигенізований продукт і регенеруючи спокій форму ферменту. «Пероксидний шунт» відноситься до механізму, запропонованого для цитохромової P450-каталізованої оксигенації субстратів донорами однокисневих атомів (див. Текст). Вважається, що той же високовалентний залізооксопроміжний продукт генерується і в цих типах реакцій.

Для цитохрому Р-450 питання, яке, можливо, найбільше цікавить біонеорганічного хіміка, полягає в тому, який механізм дозволяє активувати диоксиген та його реакцію з субстратом. Здається зрозумілим, що диоксиген зв'язується з залізистим станом ферментно-субстратного комплексу, і що отриманий оксиліганд, який імовірно схожий на окси-ліганд в оксигемоглобіні і оксиміоглобіні, недостатньо реактивний, щоб атакувати зв'язаний субстрат. Потім окси-форма відновлюється і утворюється активний окислювач, але природа активного окислювача не була виведена з досліджень самого ферменту, а також не вдалося спостерігати та характеризувати проміжні продукти, що відбуваються між часом відновлення та вивільненням продукту. Три види є потенційними кандидатами на «активний кисень», кисневмісних видів, які атакують субстрат, у цитохромі P-450. Ними є:

1. пероксо заліза, 1а, або гідропероксокомплекс, 1b, утворений в результаті одноелектронного відновлення оксикомплексу (Реакція 5.65);
2. оксокомплекс заліза (IV), 2, утворений гомолітичним розщепленням O—O зв'язків заліза гідропероксокомплексу (Reaction 5.66); і
3. комплекс на рівні окислення оксокомплексу заліза (V), 3, утворений гетеролітичним розщепленням O—O зв'язків заліза гідропероксокомплексу (Реакція 5.67).

Гідроксильний радикал, HO•, хоча і високореактивний і здатний атакувати субстрати Р-450, вважається малоймовірним кандидатом на «активний кисень» через нерозбірливий характер його реакційної здатності.

\[Fe^{II}P + O_{2} \rightarrow FePO_{2} \xrightarrow{e^{-}} [Fe^{III}P(O_{2}^{2-})]^{-} \xrightarrow{H^{+}} Fe^{III}P(O_{2}H^{-}) \tag{5.65}\]

\[\qquad \qquad \qquad \qquad \qquad \bf{1a} \qquad \qquad \qquad \qquad \bf{1b}\]

\[Fe^{III}P(O_{2}H^{-}) \rightarrow Fe^{IV}P(O) + HO \cdotp \tag{5.66}\]

\[\bf{1b} \qquad \qquad \qquad \bf{2}\]

\[Fe^{III}P(O_{2}H^{-}) \rightarrow [Fe^{V}(P^{2-})(O)^{+} \leftrightarrow Fe^{IV}(P^{-})(O)^{+}] +HO^{-} \tag{5.67}\]

\[\bf{1b} \qquad \qquad \qquad\qquad \qquad \qquad \bf{3} \qquad \qquad \qquad \]

(Р ^2- = порфіриновий ліганд; Р ^- = одноелектронний окислений порфіриновий ліганд)

Оксокомплекс заліза (V) (або споріднений вид на тому ж рівні окислення), 3, утворений за допомогою Reaction (5.67), є сприятливим кандидатом для «активного кисню» в цитохромі P-450. ⁸¹ Цей висновок спочатку був зроблений з досліджень реакцій ферменту з алкілгідропероксидами і донорами однокисневих атомів. Донори однокисневого атома - це такі реагенти, як йодозилбензол, OiPH і періодат, IO ₄ ^-, здатні дарувати акцептору нейтральний атом кисню, утворюючи стабільний продукт в процесі (тут йодбензол, iPH і йодат, IO ₃ ^-). Було виявлено, що цитохром заліза Р-450 може каталізувати реакції оксигенації за допомогою органічних пероксидів або донорів однокисневого атома замість диоксигену та відновників. Зазвичай ті ж субстрати дають ідентичний продукт, насичений киснем. Цей шлях реакції іменувався як «перекисний шунт» (див. Рис. Наслідком цього відкриття було те, що в кожній реакції утворювалася одна і та ж форма «активного кисню», і той факт, що донори однокисневого атома могли керувати цією реакцією, означав, що цей вид містив лише один атом кисню, тобто був створений після розщеплення зв'язку O—O. Механізм, запропонований для цієї реакції, був Реакція (5.68) і (5.69).

\[Fe(III)P^{+} + OX \rightarrow \textbf{3} + X \tag{5.68}\]

\[\textbf{3} + substrate \rightarrow Fe(III)P^{+} + substrate(O) \tag{5.69}\]

b. модельні системи металопорфірину

Дослідження реактивності синтетичних металопорфіринових комплексів в реакціях перенесення кисню та характеристика проміжних видів, що спостерігалися під час таких реакцій, були неоціненними при оцінці потенційних проміжних продуктів та шляхів реакції для цитохрому Р-450. Логічно, було б найбільш бажано, якби можна було імітувати ферментативні реакції оксигенації субстратів, використовуючи порфірини заліза, диоксиген та відновники. Однак дослідження таких реакцій, що каталізуються залізо-порфірином, не змогли дати значущих результатів, які могли б бути пов'язані з механізмом Р-450. Це, мабуть, не дивно, оскільки ферментна система призначена для воронки електронів в комплекс залізо-діоксиген-субстрат і таким чином генерувати активний окислювач в межах активної ділянки ферменту в безпосередній близькості від пов'язаного субстрату. Однак без обмежень, накладених ферментом, порфірини заліза, як правило, або (1) каталізують окислення відновника диоксигентом, залишаючи субстрат недоторканим, або (2) ініціюють реакції автоокислення вільнорадикалів (див. Розділ II.C). Інший підхід був запропонований спостереженням реакції перекисного шунта (Реакції 5.68 та 5.69) з використанням органічних пероксидів або донорів однокисневого атома, і ранні успішні дослідження показали, що Fe (TPP) Cl (TPP = тетрафенілпорфірін) каталізує епоксидування олефінів та гідроксилювання аліфатичних вуглеводнів йодозилбензолом ⁸¹ (Реакції 5,70 і 5,71).

\(\tag{5.70}\)

\(\tag{5.71}\)

Реакції (5.70) і (5.71) були постульовані, щоб відбуватися через окислювач, пов'язаний із залізом, такий як 3 в реакції (5,67). Ця гіпотеза була перевірена шляхом вивчення реакції діоктилу Fe (PPIX) CI з йодозилбензолом, що призвело до 60-відсоткового гідроксилювання в позиціях 4 і 5 на хвості вуглеводнів (див. 5.72), позиції для яких немає підстав очікувати підвищеної реактивності, за винятком того, що ті конкретні Місця прогнозуються з молекулярних моделей, щоб наблизитися до центру заліза, коли хвіст обертається навколо молекули порфірину. ⁸²

\(\tag{5.72}\)

Малюнок 5.11). ⁸³

Малюнок 5.11 - Порівняльні дані Мессбауера для залізо-порфіринових комплексів: ⬛ високоспіновий Fe ^LiL, ⬜ низькоспіновий Fe ^LiL, проміжний спін (домішаний) Fe ^LiL, high-spin Fe ^ll, △ low-spin Fe ^ll , ▲ оксо- і імідо-Fe ^IV, * диметоксіірон (IV) TMP. Вставка показує спектр Мессбауера з нульовим полем ⁵⁷ FE-диметоксизаліза (IV) TMP при 4,2 К. (З посилання 83.)

Видимі спектри поглинання порфіринових комплексів обумовлені значною мірою\(\pi\) -\(\pi\) * переходами порфіринового ліганду. Яскраво-зелений колір незвичний для залізо-порфіринових комплексів, які зазвичай червоного або фіолетового кольору. (Однак цей зелений колір був помічений для сполуки I каталази та пероксидаз; див. Розділ VI нижче.) Незвично довгохвильові видимі смуги поглинання, які складають зелений колір, виникають внаслідок того, що порфіринове кільце окислено одним електроном. Подібні видимі смуги поглинання можна побачити, наприклад, в інших окислених комплексах порфірину, таких як Co ^iLi (P ^•-) ⁺, утворених двоелектронним окисленням Co ^Li (P ^2-) (див. 5.73). ⁸⁴

\(\tag{5.73}\)

Окислені порфіринові ліганди також дають характерні протонні ЯМР-спектри, які спостерігаються і для комплексу зеленого порфірину. ^81,83

Магнітні вимірювання показують, що зелений комплекс порфірину містить три непарних електрона. Детальний аналіз спектрів Мессбауера показав, що два непарні електрони на іоні Fe ^IV сильно феромагнетично пов'язані з непарним електроном на порфірині, що враховує результуючий S =\(\frac{5}{3}\) стан. ^81,83

\(\tag{5.74}\)

Дослідження реакцій цього виду з субстратами типу P-450 демонструють, що цей вид досить реактивний, щоб зробити його привабливим кандидатом на «активний кисень» в ферментативному механізмі. ^81,83

Також синтезовано синтетичні аналоги для двох інших кандидатів на «активний кисень» та оцінено їх реактивність. Наприклад, синтезовано пероксокомплекси Fe ^Li та Mn ^III -порфірину, аналогічні 1a в Reaction (5.65). Рентгенівська кристалічна структура комплексу Mn показує, що пероксоліганд пов'язаний з металом трикутним, боковим способом (див. 5.75). Вважається, що комплекс Fe має подібну структуру. ^85,86

\(\tag{5.75}\)

Дослідження цього виду показують, що 1a in Reaction (5.65) не матиме необхідної реактивності, щоб бути кандидатом на «активний кисень» в механізмі цитохрому P-450, оскільки він навіть не окислює трифенілфосфін, pPH ₃, до оксиду трифенілфосфіну, OPPH ₃, один з більш легких реакцій оксигенації відомих. ⁸⁷ Спроби дослідити протоновану форму, 1b в Reaction (5.65), однак вказують на те, що вона дуже нестабільна, і її реактивність ще не була ретельно вивчена. ⁸⁷ Fe ^IV -оксо-порфіринові комплекси аналогічні 2 в реакції (5,66) також були підготовлені в розчині і характеризуються ЯМР. ^60,61 Такі комплекси будуть реагувати з pPH ₃, щоб дати OPpH ₃, але відносно не реагують з олефінами і абсолютно не реагують з насиченими вуглеводнями. При цьому 2 також виключається як кандидат на «активний кисень» в механізмах Р-450.

Ці дослідження реактивності, а також спостереження за пероксидним шунтом, описані вище, свідчать про те, що Fe ^V (P ^2-) (O) ⁺ або Fe ^lV (P ^-) (O) ⁺ є найбільш ймовірним кандидатом на «активний кисень». Ці дві склади, звичайно, ізоелектронні, і спокусливо зробити висновок, що остання є більш імовірною формулюванням ферментативного проміжного продукту. Однак важливо пам'ятати, що модельні системи не мають осьового цистеїніліганду, присутнього в цитохромі Р-450. Вплив відносно легко окисленого сірчаного ліганду на розподіл електронів у межах цього проміжного продукту невідомий, оскільки модельні системи для високовалентних залізо-оксокомплексів, що містять осьові тіолатні ліганди, не синтезовані.

Механізм реакцій високовалентного оксокомплексу 3 in Reaction (5.67) з різноманітними субстратами є областю активного інтересу. ^81,88 Такі дослідження, як правило, проводяться шляхом генерації виду in situ з реакцією порфірину заліза з донором однокисневого атома, таким як перкислота або йодозилбензол. ⁸⁹. У реакціях гідроксилювання аліфатичних вуглеводнів початковим етапом, як видається, є абстрагування атома водню з субстрату з утворенням радикалу субстрату та комплексу гідроксиду Fe ^IV, утримуваного разом у клітці, створеній активною ділянкою ферменту, щоб вони не могли розсіюватися. один від одного (Реакція 5.76). Потім цей крок супроводжується рекомбінацією фрагмента OH з радикалом субстрату для отримання гідроксильованого продукту (Реакція 5.77). Цей механізм називають «механізмом відскоку кисню». ⁸³

\(\tag{5.76}\)

\(\tag{5.77}\)

Радикальний характер проміжних продуктів, що утворюються в цій реакції, підтверджується спостереженням, що такі реакції, проведені з використанням синтетичних порфіринів і донорів однокисневих атомів в присутності BrCcL ₃, дають значну кількість алкілбромідів як продуктів, результат, який є послідовним. з радикальними проміжними продуктами і не відповідають або карбонію, або карбоній-іонних проміжних продуктів. ⁸³

У самих ферментативних реакціях також є вагомі докази підтримки ступеневого механізму, що включає вільнорадикальні проміжні продукти. Наприклад, цитохром P-450 _{кулачок} дає гідроксилювання d-камфори тільки в 5- екзо положенні, але дослідження дейтерію-маркування показують, що втрачається або 5- екзо, або 5- ендо водень (Реакція 5.78). ⁸⁸

\(\tag{5.78}\)

Такі результати, очевидно, не відповідають узгодженому механізму, в якому атом кисню буде вставлений у зв'язок 5- exo C—H за один крок; тому не було б шансів на обмін воднем у двох позиціях. (Пам'ятайте, що протони спирту швидко обмінюються з водою і тому, як очікується, не залишаться второваними, коли реакція проводиться в Н ₂ О.)

Досліджено кристалічну структуру відновленого _{кулачка} цитохрому Р-450 зі зв'язаним із залізом СО та прилеглою до нього камфорою субстрату ⁹⁰ та порівняли з кристалічною структурою окисленого ферменту з камфорою, пов'язаною з камфорою. Очікується, що перший буде схожий за структурою на менш стабільний окси-комплекс. Порівняння показує, що субстратна камфора знаходиться ближче до центру заліза в окисленому ферменті. Тому можливо, що подібний рух субстрату відбувається під час каталітичної реакції після абстрагування 5- екзо або 5- ендо водню, і що нове положення молекули камфори потім обмежує крок гідроксилювання до 5- екзо-позиція. Цікаво відзначити, що 5- екзо положення на камфорі, яка гідроксильована, утримується в дуже безпосередній близькості від центру Fe ^III, а отже, до передбачуваного розташування оксоліганда в високовалентному оксо-проміжному в структурі ферменту заліза. плюс похідне камфори (рис. 5.12). Визначено також кристалічні структури ферричної форми _{кулачка} цитохрому Р-450 з норкамфорою та адамантаноном, зв'язаними замість камфори. ⁹⁰ Ці альтернативні субстрати менші, ніж камфори, і, здається, поміщаються більш вільно, ніж камфора. Тому розумно припустити, що вони певною мірою «гримлять навколо» в місці зв'язування субстрату, що, ймовірно, пояснює менш специфічну картину гідроксилювання, що спостерігається для цих альтернативних субстратів.

Малюнок 5.12 - Крайовий вид активної ділянки Р-450 зі зв'язаною молекулою камфори субстрату. ⁸⁰ Субстрат камфора знаходиться в гідрофобному кишені безпосередньо над гемом і орієнтована водневим зв'язком між карбонільним киснем камфори і Tyr-96. Положення, яке гідроксилюється в реакції оксигенації, тобто положення 5-екзо, є найближчою точкою наближення субстрату до очікуваного положення атома кисню, пов'язаного з залізом у високовалентному залізо-оксопроміжному.

Механізми епоксидації олефінів, каталізовані або ферментом, або модельними комплексами порфірину, не так добре зрозумілі, як механізми гідроксилювання аліфатичних вуглеводнів. Деякі з запропонованих можливостей ^88,91 зображені схематично на малюнку 5.13.

Малюнок 5.13 - Схематичне зображення можливих механістичних шляхів епоксидування олефінів на 3. Описані механізми - справа наліво узгоджене додавання кисню до подвійного зв'язку, реакція через металоциловий проміжний проміжний продукт, реакція через радикальний проміжний проміжний проміжний проміжний проміжний проміжок, і реакція, що протікає через початковий етап передачі електронів. ⁹¹

c O—O Розщеплення Бонда

Докази переконливі, що вид «активного кисню», який атакує субстрат у цитохромі Р-450, є високовалентним залізо-оксокомплексом. Однак механізм утворення цього виду в каталітичній реакції з диоксигеном менш добре вивчений. Гетеролітичне розщеплення O—O зв'язків гідропероксидного комплексу порфірину, 1b (Реакція 5.67), є логічним та очікуваним шляхом, але він ще не був однозначно продемонстрований у модельному комплексі. ^92,93 Ферменти каталази та пероксидази каталізують гетеролітичне розщеплення O—O зв'язку в реакціях пероксиду водню, але в них активні ділянки містять амінокислотні бічні ланцюги, розташовані для полегшення поділу розвиваючого заряду, що відбувається при гетеролітичному розщепленні (див. Розділ VI). Кристалічна структура цитохрому P-450 _{кулачка} не показує таких груп у порожнині активізіту, а також не дає жодної підказки джерелу протона для протонування пероксидного ліганда при його виробленні. ⁸⁰ Крім того, ми маємо мало експериментальних доказів щодо можливої ролі, яку може зіграти осьовий ліганд цистеїнілової сірки у полегшенні розщеплення O—O зв'язку. Ці питання залишаються областями активного інтересу для дослідників, зацікавлених в механізмах цитохрому Р-450.

Інші металовмісні ферменти монооксигенази

Як вже говорилося вище, набагато менше відомо про структурні характеристики і механізми негемових металовмісних ферментів монооксигенази. З подібності загальної стехіометрії реакцій і схожості деяких ферментів з діоксигензв'язуючими білками цілком ймовірно, що початкові етапи такі ж, як і для цитохрому Р-450, тобто зв'язування диоксиду з подальшим відновленням з утворенням металопероксиду або гідропероксиду комплекси. Не очевидно, що наступний крок однаковий, однак (тобто розщеплення O—O зв'язку з утворенням високовалентного метало-оксокомплексу перед атакою на субстрат). Проблема полягає в тому, що такий механізм генерує метало-оксокомплекси, які, як видається, містять іони металів у хімічно необгрунтованих високоокислювальних станах, наприклад, Fe ^V, Cu ^III або Cu ^IV (Реакції 5.79-5.81).

\[(Fe^{III} - OOH)^{2+} \rightarrow (Fe^{V}O)^{3+} + OH^{-} \tag{5.79}\]

\[(Cu^{II} - OOH)^{+} \rightarrow (Cu^{IV}O)^{2+} +OH^{-} \tag{5.80}\]

\[(Cu^{II} - OO - Cu^{II})^{2+} \rightarrow 2 (Cu^{III}O)^{+} \tag{5.81}\]

Альтернативний механізм полягає в тому, щоб пероксид або гідропероксид ліганд атакував субстрат безпосередньо; тобто розщеплення O—O зв'язку може бути узгоджено з атакою на субстрат. Інша можливість полягає в тому, що атом кисню вставляється в металевий зв'язок перед перенесенням на субстрат. Жоден з цих альтернативних механізмів не був продемонстрований експериментально. Ці різні можливості залишаються розглянутими, оскільки стає доступною більше інформації про ферменти монооксигенази.