5.5: Токсичність диоксигену

Фон

Перш ніж розглядати ферментативно контрольовані реакції диоксигену в живих системах, повчально розглянути неконтрольовані і згубні реакції, які також повинні відбуватися в аеробних організмах. Життя спочатку з'явилося на Землі в той час, коли атмосфера містила лише низькі концентрації диоксигену, і скорочувалася, а не окислювалася, як це є сьогодні. Однак з появою фотосинтетичних організмів приблизно 2,5 мільярда років тому перетворення в аеробну окислювальну атмосферу піддавали існуючі анаеробні організми поступово зростаючому рівню окислювального стресу. ^25,26 Сучасні анаеробні бактерії, нащадки початкових примітивних анаеробних організмів, еволюціонували таким чином, що дозволило їм уникнути контакту з нормальними атмосферними концентраціями диоксигену. Сучасні аеробні організми, навпаки, еволюціонували, розвиваючи аеробний метаболізм, щоб використовувати окислювальну силу диоксигену і, таким чином, отримати корисну метаболічну енергію. Ця надзвичайно успішна адаптація дозволила життю вижити і процвітати, коли атмосфера стала аеробною, а також дозволила розвиватися більшим, багатоклітинним організмам. Важливим аспектом диоксигенної хімії, що дозволило розвинути аеробний метаболізм, є відносно повільна швидкість диоксигенних реакцій при відсутності каталізаторів. Таким чином, ферменти можуть використовуватися для направлення та контролю окислення субстратів або для виробництва енергії, або для біосинтезу. Тим не менш, баланс, досягнутий між конструктивним і руйнівним окисленням, є делікатним, підтримується в аеробних організмах декількома способами, наприклад: компартменталізація окислювальних реакцій в мітохондріях, пероксисомах і хлоропластах; очищення або детоксикація токсичних побічних продуктів диоксигену реакції; відновлення деяких типів окислювально-пошкоджених видів; деградація та заміна інших видів. ⁶

Класифікація «анаеробні» фактично включає організми з різним ступенем толерантності до диоксигену: суворі анаероби, для яких токсичні навіть невеликі концентрації O ₂; помірні анаероби, які можуть переносити низький рівень диоксигену; і мікроаерофіли, які вимагають низьких концентрацій О ₂ для зростання, але не переносять нормальних атмосферних концентрацій, тобто 21 відсоток O ₂, 1 атм тиску. Анаеробні організми процвітають в місцях, захищених від атмосфери, наприклад, в гниючому органічному матеріалі, гниючих зубах, товстій кишці та гангренозних ранах. Диоксиген, здається, токсичний для анаеробних організмів значною мірою тому, що він виснажує відновлювальні еквіваленти в клітині, необхідні для нормальних біосинтетичних реакцій. ⁶

Аеробні організми можуть, звичайно, жити в середовищах, в яких вони піддаються впливу нормальних атмосферних концентрацій O ₂. Тим не менш, є багато доказів того, що O ₂ токсичний і для цих організмів. Наприклад, спостерігалося, що рослини, вирощені в різних концентраціях O ₂, ростуть швидше в нижчих, ніж нормальних, концентраціях O ₂. ²⁷ кишкова паличка, вирощена під 5 атм O ₂, перестала рости, якщо середовище росту не була доповнена амінокислотами або попередниками з розгалуженим ланцюгом. Високі концентрації O ₂ пошкодили фермент дигідроксикислотної дегідратази, важливого компонента біосинтетичного шляху для цих амінокислот. ²⁸ У ссавців підвищений рівень О ₂ явно токсичний, приводячи спочатку до кашлю і хворобливості горла, а потім до судом при досягненні рівня 5 атм 100 відсотків О ₂. Зрештою, підвищені концентрації O ₂ призводять до набряку легенів і незворотного пошкодження легенів, з очевидним пошкодженням і інших тканин. ⁶ Вплив високих концентрацій O ₂ на людину представляє певний медичний інтерес, оскільки диоксиген використовується терапевтично для пацієнтів, які відчувають утруднене дихання, або для тих, хто страждає від інфекції анаеробними організмами. ⁶

Біологічні цілі

Основними біохімічними мішенями токсичності O ₂, як видається, є ліпіди, ДНК та білки. Хімічні реакції, що враховують пошкодження кожного типу мішені, ймовірно, різні не тільки через різну реакційну здатність цих трьох класів молекул, але і через різне середовище для кожного всередині клітини. Ліпіди, наприклад, є необхідними компонентами мембран і надзвичайно гідрофобні. Окислювальне пошкодження, яке спостерігається, обумовлено вільнорадикальним аутоокисленням (див. Реакції 5.16 - 5.21), а спостережувані продукти - гідропероксиди ліпідів (див. Реакція 5.23). Введення гідропероксидної групи у внутрішню частину ліпідного бішару, мабуть, призводить до того, що ця структура порушується, оскільки конфігурація ліпідів перебудовується, щоб вивести цю полярну групу з внутрішньої частини гідрофобної мембрани та до інтерфейсу мембрана-вода. ⁶ ДНК, навпаки, знаходиться у внутрішній частині клітини, а її оголені ділянки оточені водним середовищем. Він особливо вразливий до окислювальної атаки біля основи або на цукрі, а множинні продукти утворюються при впливі зразків окислювачів in vitro. ⁶ Оскільки окислення ДНК in vivo може призвести до мутацій, цей тип пошкодження потенційно дуже серйозний. Білки також зазнають окисного пошкодження, причому амінокислотні бічні ланцюги, особливо сірковмісні залишки цистеїну та метіоніну, виявляються найбільш вразливими ділянками. ⁶

Оборонні та ремонтні системи

Біологічні захисні системи, що захищають від окислювального пошкодження та його наслідків, узагальнені нижче.

1. Поглиначі неферментативних окислювачів

Деякі приклади маломолекулярних антиоксидантів\(\alpha\) - токоферол (вітамін Е; 5,24), який міститься в розчиненому в клітинних мембранах і захищає їх від перекисного окислення ліпідів, і аскорбат (вітамін С; 5,25) і глутатіон (5,26), які містяться в цитозолі багатьох клітин. Деякі інші відомі, а також. ^6,29

\(\tag{5.24}\)

\(\tag{5.25}\)

\(\tag{5.26}\)

2. Ферменти детоксикації

Ферментативними антиоксидантами є (а) каталаза і різні пероксидази, присутність яких знижує концентрацію пероксиду водню, тим самим запобігаючи його вступу в потенційно шкідливі реакції з різними компонентами клітин (див. Розділ VI і Реакції 5.82 і 5.83), і (б) супероксид дисмутази, присутність яких забезпечує захист від диоксигенної токсичності, яка, як вважається, опосередкована супероксидним аніоном, O ₂ ^- (див. Розділ VII і Реакція 5.95).

Деякі з ферментативних і неферментативних антиоксидантів в клітині проілюстровані на малюнку 5.1.

Малюнок 5.1 - Мультфільм показує деякі антиоксидантні агенти всередині клітини. ²⁹

3. Системи секвестрації окисно-активних іонів металів

Редокс-активні іони металів присутні в клітині у вільному, некомплексному стані тільки в вкрай низьких концентраціях. Натомість вони секвестровані білками зберігання та транспортування іонів металів, такими як феритин та трансферин для заліза (див. Розділ 1) та церулоплазмін для міді. Таке розташування запобігає каталізації таких іонів металів шкідливих окислювальних реакцій, але робить їх доступними для включення в металоферменти, оскільки вони необхідні.

Експерименти in vitro показали досить чітко, що окислювально-активні іони металів, такі як Fe ^2+/3+ або Cu ^+/2+, є надзвичайно хорошими каталізаторами окислення сульфгідрильних груп O ₂ (Reaction 5.27). ³⁰

\[4RSH + O_{2} \xrightarrow{M^{n+}} 2RSSR + 2H_{2}O \tag{5.27}\]

Крім того, у відновлювальному середовищі клітини окисно-активні іони металів каталізують дуже ефективне одноелектронне відновлення пероксиду водню з отриманням гідроксильного радикала, одного з найпотужніших і реактивних окислювачів, відомих (Реакції від 5.28 до 5.30). ³¹

\[M^{n+} + Red^{-} \rightarrow M^{(n-1)+} + Red \tag{5.28}\]

\[M^{(n-1)+} + H_{2}O_{2} \rightarrow M^{n+} + OH^{-} + HO \cdotp \tag{5.29}\]

---

\[Red^{-} + H_{2}O_{2} \rightarrow Red + OH^{-} + HO \cdotp \tag{5.30}\]

\[(Red^{-} = reducing\; agent)\]

Зв'язування цих іонів металів у металопротеїні зазвичай запобігає їх вступу в ці типи реакцій. Наприклад, трансферин, фермент транспортування заліза в сироватці крові, в нормі насичений залізом лише на 30 відсотків. В умовах зростаючої перевантаження залізом спостережуються порожні залізозв'язуючі ділянки на трансферину, а симптоми отруєння залізом не спостерігаються in vivo до того моменту, як трансферин повністю насичується залізом. ³² Церулоплазмін і металотіонеїн можуть відігравати подібну роль у запобіганні токсичності міді. ⁶ Дуже ймовірно, що токсичність як заліза, так і міді значною мірою обумовлена каталізом реакцій окислення цими іонами металів.

4. Системи для ремонту або заміни пошкоджених матеріалів

Ремонт окисного пошкодження має йти постійно, навіть при нормальних умовах аеробного обміну. Для ліпідів відновлення перекисних жирно-кислотних ланцюгів каталізується фосфоліпазою A ₂, яка розпізнає структурні зміни на межі розділу ліпід-вода, спричинені гідропероксидом жирної кислоти, і каталізує видалення жирної кислоти на цьому місці. Потім ремонт завершується ферментативною реакцією. ⁶ Хоча деякі окислювально-пошкоджені білки відновлюються, частіше такі білки розпізнаються, розкладаються в прискореному темпі, а потім замінюються. ⁶ Для ДНК існує кілька мультиферментних систем, функція яких полягає у відновленні окислювально-пошкодженої ДНК. ⁶ Наприклад, одна така система каталізує розпізнавання і видалення пошкоджених основ, видалення пошкодженої частини нитки, синтез нової ДНК для заповнення прогалин і релігацію для відновлення ДНК до початкового, неушкодженого стану. Мутантні організми, яким не вистачає цих ремонтних ферментів, виявляються гіперчутливими до O ₂, H _{2 O 2} або інших окислювачів. ⁶

Один особливо цікавий аспект окислювального стресу полягає в тому, що більшість аеробних організмів можуть вижити в присутності нормально летальних рівнів окислювачів, якщо вони вперше піддавалися впливу більш низьких, нетоксичних рівнів окислювачів. Це явище спостерігалося у тварин, рослин, дріжджів та бактерій, і свідчить про те, що низький рівень окислювачів спричиняє індукування антиоксидантних систем in vivo. У певних бактерій механізм цієї індукції хоча б частково зрозумілий. ДНК-зв'язуючий регуляторний білок під назвою OxyR, який існує в двох окислювально-відновних станах, був ідентифікований у цих системах. ³³ Підвищений окислювальний стрес імовірно збільшує концентрацію окисленої форми, яка потім діє, щоб включити транскрипцію генів для деяких антиоксидантних ферментів. Пов'язане явище може виникнути, коли бактерії та дріжджі переходять з анаеробного обміну на аеробний. Коли диоксиген відсутній, ці мікроорганізми живуть шляхом бродіння, і не витрачають енергію, синтезуючи ферменти та інші білки, необхідні для аеробного обміну. Однак при їх впливі диоксигену включається синтез дихального апарату. Подробиці цієї індукції не відомі повністю, але деякі етапи принаймні залежать від наявності гема, протезної групи гемоглобіну та інших гемових білків, синтез яких вимагає наявності диоксигену. ³⁴

Молекулярні механізми диоксигенної токсичності

Те, що залишилося поза попереднім обговоренням, - це ідентифікація видів, відповідальних за окислювальне пошкодження, тобто агентів, які безпосередньо атакують різні вразливі цілі в клітині. Вони були залишені, оскільки деталі хімії, відповідальної за токсичність диоксигену, значною мірою невідомі. У 1954 році Ребека Гершман сформулювала «вільнорадикальну теорію токсичності кисню», зазначивши, що тканини, що піддаються іонізуючому випромінюванню, нагадують ті, що піддаються підвищеному рівню диоксигену. ³⁵ Чотирнадцять років потому Ірвін Фрідович запропонував, що вільним радикалом, відповідальним за токсичність диоксиду, був супероксид, O ₂ ^-, заснований на його ідентифікації першого з ферментів супероксиддисмутази. ³⁶ Сьогодні досі невідомо, чи супероксид є основним агентом токсичності диоксиду, і якщо так, то якою є хімія, відповідальна за цю токсичність. ⁶

Немає сумніву, що супероксид утворюється при нормальному перебігу аеробного метаболізму, ¹²¹ хоча і складно отримати оцінки кількості при різних умовах, тому що навіть при відсутності каталізатора супероксид досить швидко диспропорційно діоксиду і водню. пероксид (Реакція 5.4) і тому ніколи не накопичується в якійсь великій мірі в клітині при нормальних умовах рН. ³⁷

Однією з основних проблем у цій галузі є те, що задовільного хімічного пояснення передбачуваної токсичності супероксиду ніколи не було знайдено, незважаючи на багато непрямих доказів експериментів in vitro, що наявність супероксиду може призвести до небажаного окислення різних клітинних компонентів і що таке окислення може гальмуватися супероксиддисмутазою. ³⁸ Найпоширенішим механізмом є виробництво гідроксильних радикалів за допомогою реакцій (5.28) до (5.30) з червоним ^- = O ₂ ^-, що називається «каталізованою металом реакцією Габера-Вайса». Роль супероксиду в цьому механізмі полягає у зменшенні окислених іонів металів, таких як Cu ²⁺ або Fe ³⁺, присутні в клітині в слідових кількостях, до більш низького ступеня окислення. ³⁷ Гідроксильний радикал є надзвичайно потужним і нерозбірливим окислювачем. Він може абстрагувати атоми водню з органічних субстратів і дуже швидко окислювати більшість відновників. Він також є дуже ефективним ініціатором реакцій автоокислення вільнорадикалів (див. Розділ II.C вище). Тому реакції, які виробляють гідроксильний радикал в живій клітині, ймовірно, будуть дуже згубними. ⁶

Проблема з цим поясненням токсичності супероксиду полягає в тому, що єдина роль, яку відіграє супероксид, - це відновник іонів мікрометалів. Однак внутрішня частина клітини є сильно відновлювальним середовищем, а інші відновники, природно присутні в клітині, такі як, наприклад, аніон аскорбат, також можуть діяти як червоний ^- в реакції (5,28), і результуючі реакції окислення через гідроксильний радикал, отже, більше не інгібуються по СОД. ³⁹

Інші можливі пояснення токсичності супероксиду існують, звичайно, але жодне ніколи не було продемонстровано експериментально. Супероксид може зв'язуватися зі специфічним ферментом і пригнічувати його, так само, як цитохромоксидаза інгібується ціанідом або гемоглобіном чадним газом. Деякі ферменти можуть бути надзвичайно чутливими до прямого окислення супероксидом, як було запропоновано для ферменту аконітази, ферменту залізо-сірки, який містить відкритий атом заліза. ¹²² Інша можливість полягає в тому, що протонована і, отже, нейтральна форма супероксиду, HO ₂, розчиняється в мембранах і виступає ініціатором перекисного окислення ліпідів. Було також припущено, що супероксид може реагувати з оксидом азоту, NO, в клітині, що виробляє пероксинітрит, дуже потужний окислювач. ¹²³ Одним з особливо привабливих механізмів токсичності супероксиду, який завоював прихильність в останні роки, є «Механізм Хабера-Вайса, специфічний для сайту». ^40,41 Ідея полягає в тому, що сліди окислювально-активних іонів металів, таких як мідь і залізо, пов'язані з макромолекулами в нормальних умовах в клітині. Більшість відновників в клітині занадто громіздкі, щоб прийти в безпосередній близькості від цих секвестрованих іонів металів. Супероксид, однак, крім того, що є відмінним відновником, дуже малий і може проникати до цих іонів металів і зменшувати їх. Потім відновлені іони металів могли реагувати з перекисом водню, генеруючи гідроксильний радикал, який негайно атакує ділянку поблизу місця розташування пов'язаного іона металу. Цей механізм дуже схожий на механізм металевих комплексів, що викликають розщеплення ДНК; реагуючи з перекисом водню, зв'язуючись з ДНК, вони генерують потужні окислювачі, які реагують з ДНК з високою ефективністю через їх близькість до неї (див. Розділ 8).

Хоча ми не впевнені, які конкретні хімічні реакції супероксид може пройти всередині клітини, проте існують вагомі докази того, що супероксиддисмутази відіграють важливу роль у захисті від пошкоджень, викликаних диоксигеном. Мутантні штами бактерій і дріжджів, яким не вистачає супероксиддисмутаз, гинуть підвищеними концентраціями диоксигену, які не впливають на клітини дикого типу. Ця надзвичайна чутливість до диоксигену полегшується, коли ген, кодуючий супероксиддисмутазу, знову вставляється в клітину, навіть якщо новий СОД іншого типу і з іншого організму. ^42,43

Резюме диоксигенної токсичності

Підводячи підсумок, ми знаємо багато про ділянки, вразливі до окислювального пошкодження в біологічних системах, про засоби, що захищають від таких пошкоджень, і про механізми, що відновлюють такі пошкодження. Іони металів беруть участь у всій цій хімії, як як каталізатори шкідливих окислювальних реакцій, так і як кофактори в ферментах, які захищають і відновлюють такі пошкодження. Однак ми досі не знаємо, як диоксиген ініціює послідовність хімічних реакцій, які виробляють агенти, які атакують вразливі біологічні цілі in vivo.