5.7: оксигенази

Фон

Ферменти оксигенази каталізують реакції диоксигенази з органічними субстратами, в яких атоми кисню з диоксигену включаються в кінцевий окислений продукт. ^2-4 Ці ферменти можна розділити на диоксигенази, які направляють обидва атоми кисню в продукт (Реакція 5.53), і монооксигенази, де один атом кисню з диоксигенази знаходиться в продукті, а інший відновлений до води (Реакція 5.54):

\[Dioxygenase:\; substrate + \;^{*}O_{2} \rightarrow substrate(^{*}O)_{2} \tag{5.53}\]

\[Monoxygenase:\; substrate + \;^{*}O_{2} + 2 H^{+} + 2e^{-} \rightarrow substrate(^{*}O) + H_{2}\;^{*}O \tag{5.54}\]

Диоксигенази

Відомі ферменти диоксигенази, які містять гемове залізо, негемове залізо, мідь або марганець. ^66,67 Субстрати, оксигенація яких каталізується цими ферментами, дуже різноманітні, як і місця зв'язування металів; тому, ймовірно, кілька, можливо, не пов'язаних, механізмів працюють в цих різних системах, Для багатьох з цих ферментів ще не так багато детальної механістичної інформації. Однак деякі інтрадіолкатехол-диоксигенази, виділені з бактеріальних джерел, були вивчені дуже детально, і доступна як структурна, так і механістична інформація. ^66,67 Це системи, які будуть описані тут.

1. Інтрадіоло-катехол-диоксигенази

Роль цих негемових залізовмісних ферментів полягає в каталізації деградації похідних катехолу для отримання муконових кислот (Реакція 5.55, наприклад). Ферменти індукуються, коли єдиними джерелами вуглецю, доступними для бактерій, є ароматичні молекули. Двома найбільш характеризуваними членами цього класу є катехол 1,2-диоксигеназа (CTD) та протокатехуат 3,4-диоксигеназа (PCD).

\(\tag{5.55}\)

a. характеристика активних сайтів

Ще до того, як була отримана рентгенівська кристалічна структура ПХД, картина активної ділянки була побудована детальною спектроскопічною роботою з використанням різноманітних методів. Успіх спектроскопічного аналізу цих ферментів є особливо хорошим прикладом важливості та корисності таких методів при характеристиці металопротеїнів. Два ферменти, про які йдеться в Реакція (5.55), мають різні молекулярні маси та субодиниці композиції, ⁶⁶ але, мабуть, містять дуже схожі структури активного сайту та функціонують дуже схожими механізмами. В обох стані спокою ферменту міститься один іон Fe ^III, пов'язаний на активній ділянці. Спектри ЕПР показують резонанс при g = 4.3, характерний для високоспінового Fe ^III в так званому ромбічному (низька симетрія) середовищі, ⁶⁶ і параметри Мессбауера також характерні для високоспінового заліза. ^66-68 Реакції з аналогами субстрату (див. Нижче) викликають спектральні зрушення хромофора заліза, що свідчить про те, що субстрат зв'язується безпосередньо з центром заліза в ході ферментативної реакції.

Виключити наявність гема в цих ферментах нескладно, оскільки хромофор гема має характерні смуги електронного поглинання у видимій і ультрафіолетовій областях з високими коефіцієнтами згасання, які не спостерігаються для цих білків. Аналогічно не спостерігається спектральних ознак, характерних для інших відомих кофакторів або залізо-сірчаних центрів. Натомість домінуючою ознакою у видимому спектрі поглинання є смуга з максимумом близько 460 нм і молярним коефіцієнтом екстинкції від 3000 до 4000 М ^{-1 см -1} на залізо (див. Рис.

Малюнок 5.5 - Видимі спектри поглинання катехолу 1,2-діоксигенази та її субстратного комплексу: Е, нативний фермент; ES, ферментно-субстратний комплекс. ⁶⁶

Цей тип електронного спектра поглинання характерний для класу білків, іноді їх називають білками тирозинату заліза, які містять тирозин-ліганди, пов'язані з залізом (III) у своїх активних ділянках, і які, отже, показують характерний видимий спектр поглинання через фенолат-залізо (III) переходи заряду-передачі. Це призначення може бути остаточно доведено дослідженням резонансного спектру комбінаційного випромінювання, що показує посилення характерних коливальних режимів тирозину (зазвичай ~ 1170, 1270, 1500 та 1600 см ^-1) при опроміненні зразка в описаній вище смузі передачі заряду. Можна побачити, що залізні комплекси фенолатних лігандів дають майже однакові резонансні спектри Рамана (див. Рис.

Малюнок 5.6 - Резонансні спектри комбінаційного випромінювання (А) Fe ^Li (сален) (O - C ₆ H _{4 -4} - CH ₃) і (B) катехолу 1,2-диоксигенази. ⁶⁶

Ці смуги були призначені як вібрація вигину C—H та C—O та два коливання розтягування C—C фенолатного ліганду. ⁶⁹ Крім того, дослідження ЯМР швидкості релаксації протонних спінів води свідчать про те, що вода взаємодіє з парамагнітним центром Fe ^III в ферменті. Цей висновок підтверджується розширенням сигналу Fe ^III EPR в присутності H ₂ ¹⁷ O, внаслідок взаємодії з I =\(\frac{5}{2}\) ядерним спіном ¹⁷ О. Таким чином численні спектроскопічні дослідження катехольних диоксигеназ привели до прогнозування того, що іон заліза з високим спіном був пов'язаний з тирозинними лігандами та водою. Крім того, дані EXAFS, а також схожість спектральних властивостей з іншим, краще характеризуються залізо-тирозинатним білком, тобто трансферином (див. Главу 1), припускають, що гістидини також будуть знайдені як ліганди до заліза в цих білках. ^66,67

Попередні рентгенівські кристалографічні результати на протокатехуат 3,4-діоксигенази повністю підтверджують попередні прогнози, засновані на спектроскопічних дослідженнях. ⁷⁰ Центр Fe ^iLi пов'язаний з двома гістидином та двома тирозинними лігандами та водою, п'ять лігандів розташовані в тригональному біпірамідному розташуванні, з тирозином та гістидином, розташованими в осьових положеннях, і з екваторіальною водою або гідроксидом лігандом, зверненим до порожнину передбачається, що підкладка-зв'язує порожнину. Порожнина також містить позитивно заряджену гуанідинієву групу бічного ланцюга аргініну, що знаходиться в правильному положенні для взаємодії з негативно зарядженою карбоксилатною групою на протокатехуатной підкладці (див. Рис.

Малюнок 5.7 - Вид активної ділянки протокатехуат 3,4-диоксигенази за результатами рентгенівської кристалічної структури. ⁷⁰ Центр Fe ^III приблизно тригональний біпірамідний, з Tyr-147 і His-162 як осьові ліганди, а Tyr-108 і His-160 в екваторіальній площині разом з молекулою розчинника (не показано) на передньому плані. ⁶⁶

b. механістичні дослідження

Як уже згадувалося вище, субстрати та інгібітори, які є субстратними аналогами, зв'язуються з цими ферментами і викликають чіткі зміни спектральних властивостей, що сильно свідчить про те, що вони взаємодіють безпосередньо з центром Fe ^III. Тим не менш, спектри залишаються характерними для ступеня окислення Fe ^Iil, що свідчить про те, що центр заліза не був зменшений. Катехолати є чудовими лігандами для Fe ^III (див., наприклад, сидерофори катехолатів, глава 1), і тому можна припустити, що субстрат катехолу зв'яжеться із залізом за допомогою обох атомів кисню (див. 5.56).

\(\tag{5.56}\)

Однак спостереження про те, що фенольні інгібітори P-x-c ₆ H ₄ -OH міцно зв'язуються з ферментами, припускало можливість того, що субстрат зв'язується з центром заліза лише через один атом кисню (див.

\(\tag{5.57}\)

Малюнок 5.8).

Малюнок 5.8 - (A) Парамагнітно зміщені ¹ H-ЯМР спектри комплексів Fe (сален) з 4-метилфенолатними і 4-метилкатехолатними лігандами. Зірчасті резонанси призначаються метильним групам. Верхній спектр - залізо-саленовий комплекс монодентатного 4-метилфенолатного ліганду. Середній спектр - залізо-саленовий комплекс монопротонованого 4-метилкатехолатного ліганду. Зверніть увагу, що два ізомери присутні, оскільки два атоми кисню на ліганді нееквівалентні, і будь-який може бути використаний для створення монодентатного комплексу. Нижній спектр - залізо-саленовий комплекс повністю депротонованого 4-метилкатехолатного ліганду, який зв'язується з залізом бідентатним способом. Зверніть увагу на менший проміжок ізотропних зрушень, який було продемонстровано як діагностику бідентатної координації. (B) Парамагнітно зміщені ¹ Н-ЯМР спектри ферментно-субстратних комплексів диоксигеназних ферментів катехолу 1,2-діоксигенази (CTD) та протокатехолат-3,4-диоксигенази (PCD). Зверніть увагу на схожість між положенням метильного резонансу в комплексі 4-метилкатехолу з CTD та положенням одного з метилових резонансів у середньому спектрі в (A), що вказує на те, що 4-метилкатехол зв'язується з центром заліза в CTD монодентатним способом лише через кисень O-1. На відміну від цього, спектр 4-метилкатехолу з ПХД нагадує нижній спектр в (А), вказуючи на те, що тут 4-метилкатехолатний ліганд є бідентатом. ⁶⁶

Ці результати суперечать ранній гіпотезі про те, що спосіб зв'язування субстрату, тобто монодентат проти бідентату, може бути вирішальним фактором активації субстрату для реакції з диоксигеном. ⁶⁷

Спектроскопічні спостереження ферментів під час реакцій з субстратами та аналогами субстрату дозволили дослідникам спостерігати кілька проміжних продуктів вздовж каталітичного шляху. Такі дослідження привели до висновку, що центр заліза залишається високоспіновим Fe ^III протягом усього перебігу реакції. Цей висновок відразу представляє проблему в розумінні природи взаємодії диоксигену з ферментом, оскільки диоксиген взагалі не взаємодіє з сильно окисленими іонами металів, такими як Fe ^III. Рішення, здається, полягає в тому, що ця реакція є прикладом субстрату, а не активації диоксигену.

Дослідження окислення координаційних комплексів катехолатів заліза були корисними для вивчення механістичних можливостей цих ферментів. ⁷¹ Виявлено, що серія комплексів заліза 3,5-ді-трет-бутил-катехолу з різними лігандами L вступає в реакцію з O ₂ для окислення катехольного ліганду (Реакція 5.58)

\(\tag{5.58}\)

Малюнок 5.9) і що комплекси лігандів, які є бідними донорами, як правило, сприяють донорству електронів від катехолу до Fe III, збільшуючи тим самим відносну кількість незначної форми B. Слід зазначити, що спектроскопічні характеристики цих комплексів все ж переважають основна резонансна форма А, незалежно від характеру Л.

Всі ці дослідження ферментів та їх модельних комплексів привели до механізму, зведеного на малюнку 5.9. ⁶⁶ У цьому запропонованому механізмі субстрат катехолу координує центр заліза або монодентатним, або бідентатним способом, імовірно витісняючи воду або гідроксид ліганд. Отриманий катехольний комплекс потім реагує з диоксигеном, щоб дати пероксидну похідну субстрату, яка залишається узгодженою з Fe ^Il. Подальша перестановка цього виду пероксида для отримання ангідридного проміжного продукту аналогічна добре охарактеризованим реакціям, які виникають при реакції катехолів з лужною перекисом водню. ⁷² Спостереження за тим, що обидва атоми кисню, отримані з O ₂, включені до продукту, вимагає, щоб комплекс оксиду заліза або гідроксиду, що утворюється на стадії, яка виробляє ангідрид, не обмінювався із зовнішньою водою перед реакцією з ангідридом, щоб відкрити його до продукт діацид.

Малюнок 5.9 - Запропонований механізм катехол-диоксигеназ (модифікований з довідки 45). Основна форма А показана тут з катехолом, пов'язаним монозубчастим способом. Іноді це може бути пов'язане також у бідентатному стилі (див. Текст).

Цікаво розглянути, як ферменти інтрадіол-диоксигенази долають кінетичні бар'єри до окислень диоксигеназами, і чому цей конкретний механізм навряд чи буде застосований до ферментів монооксигенази. Перший момент полягає в тому, що проміжний продукт катехолу заліза є парамагнітним, з резонансними формами, які ставлять непарну електронну щільність на вуглець, який реагує з диоксигеном. Тому обмеження віджиму не є проблемою. Крім того, катехольний ліганд є дуже хорошим відновником, набагато більше, ніж типові субстрати ферментів монооксигенази (див. Наступний розділ). Таким чином, можливо, що реакція диоксигену з комплексом катехолу заліза призводить до узгодженого двоелектронного переносу, щоб дати проміжний проміжний проміжок пероксиду, таким чином минаючи відносно несприятливе одноелектронне відновлення O ₂.