6.3: Виділення, культура та ідентифікація вірусів

Last updated
Save as PDF

Page ID: 3890

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Цілі навчання

Обговоріть, чому віруси спочатку описувалися як фільтровані агенти
Опишіть культивування вірусів та збір зразків та поводження з ними
Порівняйте in vivo та in vitro методи, що використовуються для культивування вірусів

На початку цієї глави ми описали, як порцелянові фільтри Chamberland з порами, досить малими, щоб дозволити вірусам проходити крізь, були використані для виявлення ВТМ. Сьогодні порцелянові фільтри замінені мембранними фільтрами та іншими пристроями, що використовуються для ізоляції та ідентифікації вірусів.

виділення вірусів

На відміну від бактерій, багато з яких можна вирощувати на штучному живильному середовищі, віруси вимагають живої клітини-господаря для реплікації. Заражені клітини господаря (еукаріотичні або прокаріотичні) можна культивувати і вирощувати, а потім середовище росту можна збирати як джерело вірусу. Віріони в рідкому середовищі можуть бути відокремлені від клітин господаря шляхом центрифугування або фільтрації. Фільтри можуть фізично видалити все, що присутнє в розчині, що більше, ніж віріони; потім віруси можуть бути зібрані в фільтраті (рис.\(\PageIndex{1}\)).

Малюнок а являє собою електронну мікрофотографію, яка показує пори і бактерії, які більше пір. Рисунок b - це малюнок, на якому зображено три частинки в контейнері над колбою. Розмір пір фільтра 5 мкм блокує найбільшу з частинок і пропускає менші дві. Розмір пір фільтра 200 нм (0,2 мкм) дозволяє лише найдрібніші частинки через. — Малюнок\(\PageIndex{1}\): Мембранні фільтри можна використовувати для видалення клітин або вірусів з розчину. (a) Ця скануюча електронна мікрофотографія показує стрижнеподібні бактеріальні клітини, захоплені на поверхні мембранного фільтра. Відзначимо відмінності в порівняльних розмірах мембран пір і бактерій. Віруси будуть проходити через цей фільтр. (б) Розмір пір у фільтрі визначає те, що захоплюється на поверхні фільтра (тварина [червоний] і бактерії [синій]) і видаляється з рідини, що проходить через нього. Зверніть увагу, що віруси (зелені) проходять через більш тонкий фільтр. (кредит a: модифікація роботи Міністерства енергетики США)

Вправа\(\PageIndex{1}\)

Який розмір пори фільтра потрібен для збору вірусу?

вирощування вірусів

Віруси можуть вирощуватися in vivo (всередині цілого живого організму, рослини або тварини) або in vitro (поза живим організмом в клітині в штучному середовищі, наприклад, пробірці, колбі культури клітин або агарової пластини). Бактеріофаги можна вирощувати в присутності щільного шару бактерій (також званих бактеріальним газоном), вирощених в 0,7% м'якому агарі в чашці Петрі або плоскої (горизонтальної) колбі (рис.\(\PageIndex{2a}\)). Концентрація агару зменшується з 1,5%, які зазвичай використовуються при культивуванні бактерій. М'який 0,7% агар дозволяє бактеріофагів легко дифузіроваться через середовище. Для літичних бактеріофагів лізування бактеріальних господарів можна легко спостерігати при виявленні прозорої зони, яка називається бляшкою (рис.\(\PageIndex{1b}\)). Оскільки фаг вбиває бактерії, серед хмарного бактеріального газону спостерігається багато бляшок.

На малюнку а показані пляшки, що лежать на боці з червоною рідиною; пляшки мають гвинтові кришки. На малюнку б показані 3 пластини, покриті бактеріальним ростом (що представляє собою гладкий бежевий газон). Кожна пластина має невеликі точки, які є областями зростання. Деякі пластини мають багато з цих бляшок, у деяких їх мало. — Рисунок\(\PageIndex{2}\): (а) Такі колби можуть бути використані для культури клітин людини або тварин для вірусного культивування. (б) Ці пластини містять бактеріофаг Т4, вирощений на газоні *кишкової палички*. Чіткі бляшки видно там, де були лізовані бактеріальні клітини господаря. Збільшуються вірусні титри на пластин зліва. (кредит a: модифікація роботи Національними інститутами охорони здоров'я; кредит b: модифікація роботи Американського товариства мікробіології)

Віруси тварин вимагають клітин всередині тварини-господаря або клітин культури тканин, отриманих від тварини. Культивування вірусу тварин має важливе значення для 1) ідентифікації та діагностики патогенних вірусів у клінічних зразках, 2) виробництва вакцин та 3) фундаментальних досліджень. Джерелами господаря in vivo може бути ембріон, що розвивається в яйці зародка птаха (наприклад, курка, індичка) або ціла тварина. Наприклад, більшість вакцини проти грипу, виготовленої для щорічних програм вакцинації проти грипу, культивується в курячих яйцях.

Ембріон або тварина-господар служить інкубатором для вірусної реплікації (рис.\(\PageIndex{3}\)). Розташування всередині ембріона або тварини-господаря має важливе значення. Багато вірусів мають тканинний тропізм, і тому їх необхідно впроваджувати в певний ділянку для зростання. Всередині ембріона цільові ділянки включають амніотичну порожнину, хоріоаллантоїчну мембрану або жовтковий мішок. Вірусна інфекція може пошкодити тканинні мембрани, виробляючи ураження, звані віспою; порушувати ембріональний розвиток; або викликати смерть ембріона.

На малюнку а зображений технік, який впорскує лоток яєць за допомогою шприца. На малюнку b показано яйце зі шприцами в різних областях, таких як зовнішній шар (хоріоаллантоїчна мембрана), внутрішня область, яка називається амніотичною порожниною та інша внутрішня область, яка називається жовтковим мішком. Ембріон з'єднаний з жовтковим мішком і знаходиться в межах навколоплідної порожнини. Поза хоріоаллантоіческой мембрани знаходиться альбумін, а навколо неї знаходиться оболонка. — Малюнок\(\PageIndex{3}\): (а) Клітини в курячих яйцях використовуються для культивування різних типів вірусів. (b) Віруси можуть бути репліковані в різних місцях всередині яйцеклітини, включаючи хоріоаллантоїчну мембрану, амніотичну порожнину та жовтковий мішок. (Кредит а: модифікація роботи «Чунг Хоанг» /YouTube)

Для досліджень in vitro можна використовувати різні типи клітин для підтримки росту вірусів. Первинна культура клітин свіжоприготовлена з органів або тканин тварин. Клітини витягуються з тканин шляхом механічного вискоблювання або подрібнення для звільнення клітин або ферментативним методом з використанням трипсину або колагенази для розщеплення тканини та вивільнення окремих клітин у суспензію. Через вимоги до якірної залежності, первинні культури клітин вимагають рідкого культурального середовища в чашці Петрі або колбі культури тканин, тому клітини мають тверду поверхню, таку як скло або пластик для кріплення та росту. Первинні культури зазвичай мають обмежений термін життя. Коли клітини первинної культури піддаються мітозу і виробляється достатня щільність клітин, клітини контактують з іншими клітинами. Коли відбувається цей контакт клітина-клітина, мітоз запускається зупинка. Це називається контактним гальмуванням, і це запобігає занадто високій щільності клітин. Для запобігання контактного гальмування клітини з первинної культури клітин повинні бути перенесені в іншу посудину зі свіжим середовищем росту. Це називається вторинною культурою клітин. Періодично щільність клітин повинна зменшуватися, виливаючи деякі клітини та додаючи свіже середовище, щоб забезпечити простір та поживні речовини для підтримки росту клітин. На відміну від первинних клітинних культур, безперервні клітинні лінії, як правило, отримані з перетворених клітин або пухлин, часто здатні підкультивуватися багато разів або навіть вирощуватися на невизначений термін (в цьому випадку їх називають безсмертними). Безперервні клітинні лінії можуть не проявляти залежність кріплення (вони будуть рости в суспензії) і, можливо, втратили гальмування контакту. В результаті безперервні клітинні лінії можуть рости купками або грудочками, що нагадують невеликі пухлинні нарости (рис.\(\PageIndex{4}\)).

Малюнок а починається з індувіальних клітин, виділених з легеневої тканини. Ці кілька клітин покладені на тарілку і є первинною культурою клітин. Ці клітини будуть рости, щоб заповнити пластину і зупиняться, коли пластина заповнена; це називається гальмуванням контакту. Для того, щоб виростити більше клітин, деякі з цих клітин переносяться на нову пластину; тепер це називається вторинною культурою клітин. Малюнок b починається з перетворених клітин або окремих клітин, виділених з пухлини, які ставляться на пластину. Ці клітини утворюють суцільну культуру, оскільки вони продовжують рости один на одного навіть після того, як пластина заповнена. — Малюнок\(\PageIndex{4}\): Клітини для культури готують шляхом відділення їх від їх тканинного матриксу. (а) Первинні культури клітин ростуть прикріпленими до поверхні контейнера для культури. Контактне гальмування уповільнює ріст клітин, як тільки вони стають занадто щільними і починають торкатися один одного. На цьому етапі зростання можна підтримувати лише шляхом створення вторинної культури. (б) Безперервні культури клітин не піддаються впливу контактного інгібування. Вони продовжують рости незалежно від щільності клітин. (кредит «мікрофотографії»: модифікація роботи Центрів контролю та профілактики захворювань)

Прикладом безсмертної клітинної лінії є клітинна лінія HelA, яка спочатку культивувалася з пухлинних клітин, отриманих від Генрієтти Лакс, пацієнтки, яка померла від раку шийки матки в 1951 році. Клітини HelA були першою безперервною клітинною лінією культури тканин і використовувалися для встановлення культури тканин як важливої технології для досліджень у клітинній біології, вірусології та медицині. До відкриття клітин HelA вченим не вдалося встановити культури тканин з будь-якою надійністю або стабільністю. Більш ніж через шість десятиліть ця клітинна лінія все ще жива і використовується для медичних досліджень. Дивіться Безсмертну клітинну лінію Генрієтти Лакс, щоб прочитати більше про цю важливу клітинну лінію та суперечливі засоби, за допомогою яких вона була отримана.

Вправа\(\PageIndex{2}\)

Яке властивість клітин робить необхідні періодичні розведення первинних клітинних культур?

Безсмертна клітинна лінія Генрієтти Лакс

У січні 1951 року Генрієтта Лакс, 30-річна афроамериканка з Балтімора, була діагностована рак шийки матки в лікарні Джона Хопкінса. Тепер ми знаємо, що її рак був викликаний вірусом папіломи людини (ВПЛ). Цитопатичні ефекти вірусу змінили характеристики її клітин в процесі, званому трансформацією, що дає клітинам здатність безперервно ділитися. Ця здатність, звичайно, призвела до ракової пухлини, яка врешті-решт вбила місіс Лакс у жовтні у віці 31 року. Перед смертю зразки її ракових клітин брали без її відома або дозволу. Зразки врешті-решт опинилися у володінні доктора Джорджа Гея, біомедичного дослідника з Університету Джона Хопкінса. Гей зміг виростити деякі клітини з зразка Лакса, створивши те, що сьогодні відомо як безсмертна клітинна лінія HelA. Ці клітини мають здатність жити і рости нескінченно довго і навіть сьогодні все ще широко використовуються в багатьох областях досліджень.

За словами чоловіка Лакса, ні Генрієтта, ні сім'я не дали лікарні дозволу на збір її зразка тканини. Дійсно, сім'я не знала лише через 20 років після смерті Лакса, що її клітини ще живі і активно використовуються в комерційних та дослідницьких цілях. Однак клітини HelA були ключовими у численних дослідницьких відкриттях, пов'язаних з поліомієлітом, раком та СНІДом, серед інших захворювань. Клітини також були комерціалізовані, хоча самі вони ніколи не були запатентовані. Незважаючи на це, маєток Генрієтти Лакс ніколи не отримував користі від використання клітин, хоча в 2013 році сім'я Лакс отримала контроль над публікацією генетичної послідовності її клітин.

Цей випадок викликає кілька біоетичних питань, пов'язаних з інформованою згодою пацієнтів та правом знати. У той час, коли тканини Лакса були взяті, не було ніяких законів або вказівок щодо інформованої згоди. Чи означає це, що в той час до неї ставилися справедливо? Звичайно, за сьогоднішніми мірками відповідь була б ні. Збір тканин або органів у вмираючого пацієнта без згоди не тільки вважається неетичним, але і незаконним, незалежно від того, чи може такий акт врятувати життя інших пацієнтів. Чи етично тоді вченим продовжувати використовувати тканини Лакса для досліджень, хоча вони були отримані незаконно за сьогоднішніми стандартами?

Етичні чи ні, клітини Лакса широко використовуються сьогодні для такої кількості додатків, що неможливо перерахувати їх усі. Це випадок, коли цілі виправдовують засоби? Чи були б Lacs раді дізнатися про її внесок у науку та мільйони людей, які отримали користь? Чи хотіла б вона, щоб її родина отримала компенсацію за комерційні продукти, розроблені з використанням її клітин? Або вона відчувала б себе порушеною та експлуатованою дослідниками, які брали частину її тіла без її згоди? Тому що її ніколи не питали, ми ніколи не дізнаємося.

Кожна клітинка містить велику синю сферу з скупченням помаранчевих овалів поруч зі сферою. Зелена павутина заповнює решту комірки. — Рисунок\(\PageIndex{5}\): Багатофотонне флуоресцентне зображення клітин HelA в культурі. Різні флуоресцентні плями були використані для показу ДНК (блакитний), мікротрубочок (зелений) та апарат Гольджі (помаранчевий). (кредит: модифікація роботи Національними інститутами охорони здоров'я)

Виявлення вірусу

Незалежно від способу культивування, після введення вірусу в цілий організм господаря, ембріон або клітину культури тканин, зразок може бути отриманий із зараженого господаря, ембріона або клітинної лінії для подальшого аналізу під яскравим полем, електронним або флуоресцентним мікроскопом. Цитопатичні ефекти (CPE) - це виразні спостережувані відхилення клітин внаслідок вірусної інфекції. CPE можуть включати втрату прилипання до поверхні контейнера, зміни форми клітин від плоскої до круглої, усадку ядра, вакуолі в цитоплазмі, злиття цитоплазматичних мембран і утворення багатоядерної синцитії, тіла включення в ядрі або цитоплазмі, а також повний лізис клітин ( див. Малюнок\(\PageIndex{6}\)).

Подальші патологічні зміни включають вірусне порушення генома господаря та зміну нормальних клітин на трансформовані клітини, які є типами клітин, пов'язаних з карциномами та саркомами. Тип або тяжкість CPE залежить від типу задіяного вірусу. На малюнку\(\PageIndex{6}\) перераховані CPE для конкретних вірусів.

Це таблиця цитопатичного впливу конкретних вірусів. Перший приклад - параміксовірус, який викликає синцит і слабкі базофільні цитоплазматичні тіла включення. Невеликі структури видно всередині клітини. Далі, Poxyvirus призводить до рожевих еозинофільних цитоплазматичних тіл включення (розглядається як дрібні структури) та набряку клітин. Далі герпесвірус викликає цитоплазматичне скручування (розглядається як елеонгація цитоплазми) та тіла ядерного включення (розглядається як структури всередині ядра). Нарешті, аденовірус викликає розширення клітин, округлення та відмінні кластери, схожі на виноград. — Малюнок\(\PageIndex{6}\): (Кредит «мікрофотографії»: модифікація роботи Американського товариства мікробіології)

Посилання на навчання

Перегляньте це відео, щоб дізнатися про вплив вірусів на клітини.

Аналіз на гемагглютинацію

Серологічний аналіз використовується для виявлення наявності певних типів вірусів в сироватці пацієнта. Сироватка - це рідка фракція плазми крові солом'яного кольору, з якої були видалені фактори згортання крові. Сироватка може бути використана в прямому аналізі, який називається гемаглютинаційним аналізом для виявлення конкретних типів вірусів у зразку пацієнта. Гемаглютинація - це аглютинація (злипання) разом еритроцитів (еритроцитів). Багато вірусів виробляють поверхневі білки або шипи, звані гемаглютиніни, які можуть зв'язуватися з рецепторами на мембранах еритроцитів і змушувати клітини агглютинуватися. Гемаглютинацію можна спостерігати без використання мікроскопа, але цей метод не завжди диференціює інфекційні та неінфекційні вірусні частинки, оскільки обидва можуть аглютинувати еритроцити.

Для виявлення конкретного патогенного вірусу за допомогою гемаглютинації треба використовувати непрямий підхід. Білки, звані антитілами, що генеруються імунною системою пацієнта для боротьби з конкретним вірусом, можуть використовуватися для зв'язування з такими компонентами, як гемаглютиніни, які однозначно пов'язані з конкретними типами вірусів. Зв'язування антитіл з виявленими на вірусі гемаглютинінів згодом перешкоджає безпосередній взаємодії еритроцитів з вірусом. Отже, коли еритроцити додаються до вірусів, покритих антитілами, немає появи аглютинації; аглютинація була пригнічена. Ми називаємо ці типи непрямих аналізів для вірусспецифічних антитіл інгібування гемаглютинації (HAI) аналізів. HAI може бути використаний для виявлення наявності антитіл, специфічних для багатьох типів вірусів, які можуть викликати або викликати інфекцію у пацієнта навіть через місяці або роки після зараження (див.\(\PageIndex{7}\) Рис. Цей аналіз більш детально описаний в аглютинаційних аналізах.

Ця діаграма має три стовпці, позначені компонентами, взаємодіями та результатами мікротитрів. У рядку А компоненти - це еритроцити, які ні з чим не взаємодіють і не виявляють жодної реакції в результаті мікротитру. Відсутність реакції розглядається як маленька червона точка в центрі колодязя. У рядку В компоненти - віруси і еритроцити. Віруси та еритроцити злипаються, і це видно в результаті мікротитру як почервоніння по всій лунці. Це називається гемаглютинацією. У рядку С складовими є віруси, еритроцити і антитіла. Віруси та антитіла злипаються, але еритроцити не згущуються ні з чим. Це знову розглядається як відсутність реакції; це називається гальмуванням гемаглютинації. — Малюнок\(\PageIndex{7}\): Ця діаграма показує можливі результати тесту на гемаглютинацію. Ряд А: Еритроцити не зв'язуються між собою і опустяться на дно колодязної пластини; це стає видно у вигляді червоної точки в центрі лунки. Ряд В: Багато вірусів мають гемаглютиніни, що викликає аглютинацію еритроцитів; отримана гемаглютинація утворює гратчасту структуру, яка призводить до червоного кольору по всій лунці. Ряд С: Вірус-специфічні антитіла, віруси і еритроцити додаються в колодязну пластину. Вірус-специфічні антитіла пригнічують аглютинацію, як це видно як червона крапка на дні лунки. (кредит: зміна роботи Центрів контролю та профілактики захворювань)

Вправа\(\PageIndex{3}\)

Який результат позитивного тесту на ОВЗ?

Тест на посилення нуклеїнової кислоти

Тести на ампліфікацію нуклеїнових кислот (NAAT) використовуються в молекулярній біології для виявлення унікальних послідовностей нуклеїнових кислот вірусів у зразках пацієнтів. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це NAAT, що використовується для виявлення наявності вірусної ДНК у зразку тканини або рідини організму пацієнта. ПЛР - це методика, яка підсилює (тобто синтезує багато копій) цікавить вірусного сегмента ДНК. Використовуючи ПЛР, короткі нуклеотидні послідовності, звані праймерами, зв'язуються з конкретними послідовностями вірусної ДНК, дозволяючи ідентифікувати вірус.

ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) - це NAAT, що використовується для виявлення наявності РНК-вірусів. ЗТ-ПЛР відрізняється від ПЛР тим, що фермент зворотної транскриптази (RT) використовується для виготовлення кДНК з невеликої кількості вірусної РНК у зразку. Потім кДНК може бути ампліфікована методом ПЛР. Як ПЛР, так і ЗТ-ПЛР використовуються для виявлення та підтвердження наявності вірусної нуклеїнової кислоти у зразках пацієнтів.

ВПЛ лякати

Мішель, 21-річна студентка медсестер, прийшла в університетську клініку, стурбована тим, що вона, можливо, піддалася захворюванню, що передається статевим шляхом (ЗПСШ). Її статевий партнер нещодавно розвинув кілька шишок на підставі пеніса. Він відклав похід до лікаря, але Мішель підозрює, що вони генітальні бородавки, викликані ВПЛ. Вона особливо стурбована тим, що знає, що ВПЛ не тільки викликає бородавки, але є важливою причиною раку шийки матки. Вона і її партнер завжди використовують презервативи для контрацепції, але вона не впевнена, що ця обережність захистить її від ВПЛ.

Лікар Мішель не виявляє фізичних ознак генітальних бородавок або будь-яких інших ЗПСШ, але рекомендує Мішель отримати мазок Папа разом з тестом на ВПЛ. Мазок Папа буде перевіряти аномальні клітини шийки матки та CPE, пов'язані з ВПЛ; тест на ВПЛ перевірить наявність вірусу. Якщо обидва тести негативні, Мішель може бути більш впевнена, що вона, швидше за все, не заразилася ВПЛ. Однак її лікар припускає, що Мішель може бути розумним зробити щеплення від ВПЛ, щоб захистити себе від можливого майбутнього впливу.

Вправа\(\PageIndex{4}\)

Чому лікар Мішель призначає два різних тести замість того, щоб покладатися на той чи інший?

Імуноферментний аналіз

Імуноферментні аналізи (ЕІА) покладаються на здатність антитіл виявляти та приєднуватися до конкретних біомолекул, званих антигенами. Виявлене антитіло прикріплюється до цільового антигену з високим ступенем специфічності в тому, що може бути складною сумішшю біомолекул. Також в цей вид аналізу входить безбарвний фермент, приєднаний до детектуючого антитіла. Фермент діє як мітка на виявлення антитіла і може взаємодіяти з безбарвним субстратом, що призводить до отримання кольорового кінцевого продукту. EIA часто покладаються на шари антитіл для захоплення і реагування з антигенами, всі вони прикріплені до мембранного фільтра (див. Рис.\(\PageIndex{8}\)). ЕІА на вірусні антигени часто використовуються в якості попередніх скринінгових тестів. Якщо результати позитивні, подальше підтвердження потребують тестів з ще більшою чутливістю, таких як західний блот або NAAT. ОВД більш детально розглядаються в ОВД та ІФА.

Пояснення ОВД відокремлено, щоб показати, що відбувається в позитивній вибірці і що відбувається в негативній вибірці. Перший зразок пацієнта наноситься на мембранний фільтр. Якщо зразок містить віруси, вони потрапляють у пастку фільтра. Далі додається антитіло з ферментним кон'югатом. Антитіло буде приєднуватися до антигену, якщо він присутній. Далі йде етап миття. Якщо вірус присутній, фермент зв'язується з вірусом, інакше фермент змивається. Нарешті додається субстрат. Якщо антитіло присутнє (оскільки воно пов'язане з вірусом) приєднаний фермент викликає зміну кольору. Якщо немає антитіла, пов'язаного з ферментами, немає, зміни кольору не відбувається. — Малюнок\(\PageIndex{8}\): Подібно до швидких, безрецептурних тестів на вагітність, ІВД для вірусних антигенів вимагає декількох крапель розведеної сироватки пацієнта або плазми, нанесеної на мембранний фільтр. Мембранний фільтр був раніше модифікований і вбудований антитілами до вірусного антигену і внутрішнім контролем. Кон'югат антитіл додається до фільтра, при цьому цільове антитіло приєднується до антигену (у випадку позитивного тесту). Надлишок кон'югату змивається з фільтра. Субстрат додають для активації опосередкованої ферментом реакції для виявлення зміни кольору позитивного тесту. (кредит: модифікація роботи «Кавітрі» /Wikimedia Commons)

Вправа\(\PageIndex{5}\)

Що зазвичай вказує на позитивний тест EIA?

Клінічна спрямованість: Частина 3

Поряд з аналізом ЗТ/ПЛР слину Девіда також збирали для вірусного культивування. Загалом, жодного діагностичного тесту не достатньо для передсмертної діагностики, оскільки результати залежатимуть від чутливості аналізу, кількості віріонів, присутніх на момент тестування, та термінів аналізу, оскільки вивільнення віріонів у слині може змінюватися. Як з'ясовується, результат виявився негативним для вірусного культивування зі слини. Це не дивно для лікаря Девіда, адже один негативний результат не є абсолютним показником відсутності інфекції. Може бути, що кількість віріонів в слині невисока на момент взяття проб. Незвично повторювати тест з інтервалами, щоб підвищити ймовірність виявлення більш високих вірусних навантажень.

Вправа\(\PageIndex{6}\)

Чи повинен лікар Девіда змінити свій курс лікування на основі цих результатів тесту?

Резюме

Вірусне культивування вимагає наявності певної форми клітини-господаря (цілого організму, ембріона або культури клітин).
Віруси можна виділити із зразків шляхом фільтрації.
Вірусний фільтрат є багатим джерелом звільнених віріонів.
Бактеріофаги виявляються за наявністю прозорих бляшок на бактеріальному газоні.
Віруси тварин і рослин виявляються за допомогою цитопатичних ефектів, молекулярних методів (ПЛР, ЗТ-ПЛР), імуноферментних аналізів та серологічних аналізів (гемагглютинаційний аналіз, аналіз на інгібування гемаглютинації).