5.13: Ремонт ДНК

ДНК в живій клітині піддається багатьом хімічним змінам (факт, який часто забувається в збудженні можливості робити секвенування ДНК на висушених та/або заморожених зразках). Якщо генетична інформація, закодована в ДНК, залишиться непошкодженою, будь-які хімічні зміни повинні бути виправлені.

Відмова від відновлення ДНК призводить до мутації.

Нещодавня публікація генома людини вже виявила 130 генів, продукти яких беруть участь у відновленні ДНК. Більше, ймовірно, буде визначено найближчим часом.

Агенти, які пошкоджують ДНК

• Певні довжини хвиль випромінювання, включаючи іонізуюче випромінювання, такі як гамма-промені та рентгенівські промені та ультрафіолетові промені, особливо ультрафіолетові промені (~ 260 нм), які сильно поглинаються ДНК, а також більш довгою хвилі UV-B, що проникає в озоновий щит.
• Високореактивні кисневі радикали, що утворюються під час нормального клітинного дихання, а також іншими біохімічними шляхами.
• Хімічні речовини в навколишньому середовищі
  • багато вуглеводнів, в тому числі деякі знайдені в сигаретному димі
  • деякі рослинні та мікробні продукти, наприклад афлатоксини, що утворюються в пліснявому арахісі
• Хімічні речовини, що застосовуються в хіміотерапії, особливо хіміотерапії ракових захворювань

Типи пошкодження ДНК

1. Всі чотири основи в ДНК (A, T, C, G) можуть бути ковалентно модифіковані в різних положеннях.
   • Однією з найбільш частих є втрата аміногрупи («дезамінація») - в результаті чого, наприклад, з перетворюється в U.
2. Невідповідність нормальних основ через збій коректури при реплікації ДНК.
   • Загальний приклад: включення піримідину U (зазвичай зустрічається лише в РНК) замість Т.
3. Розриви в хребті.
   • Може обмежуватися однією з двох ниток (одножильний обрив, SSB) або на обох нитках (a d double- s tranch break (DSB). Іонізуюче випромінювання є частою причиною, але деякі хімічні речовини виробляють розриви, а також.
4. Між базами можуть утворюватися зшивні зв'язки Ковалентні зв'язки
   • на одній і тій же нитці ДНК («внутрішньопасмовой») або
   • на протилежну пасмо («міжпасмо»).
   Кілька хіміотерапевтичних препаратів, що застосовуються проти раку, зшивають ДНК

Ремонт пошкоджених основ

Пошкоджені або невідповідні підстави можуть бути відремонтовані декількома механізмами:

• Пряме хімічне скасування пошкодження
• Видалення репарації, при якому пошкоджену основу або основи видаляють, а потім замінюють правильними в локалізованому сплеску синтезу ДНК. Існує три режими відновлення висічення, в кожному з яких задіяні спеціалізовані набори ферментів.
  1. Ремонт базового висічення (BER)
  2. Ремонт висічення нуклеотидів (NER)
  3. Ремонт невідповідності (MMR)

2015 Нобелівську премію з хімії розділили три дослідники за їх новаторську роботу в ремонті ДНК: Томас Ліндал (BER), Азіз Санкар (NER) та Пол Модріх (MMR).

Пряме скасування базового збитку

Мабуть, найчастішою причиною точкових мутацій у людини є спонтанне приєднання метильної групи (CH ₃ -) (приклад алкілування) до Cs з подальшим дезамінацією до Т. На щастя, більшість цих змін відновлюються ферментами, званими глікозилазами, які видаляють невідповідні Т відновлення правильного С. Це робиться без необхідності розриву хребта ДНК (на відміну від механізмів видалення, описаних нижче).

Деякі препарати, що застосовуються при хіміотерапії раку («хіміо»), також пошкоджують ДНК шляхом алкілування. Деякі з метильних груп можуть бути видалені білком, кодованим нашим геном MGMT. Однак білок може зробити це лише один раз, тому для видалення кожної метильної групи потрібна інша молекула білка.

Це ілюструє проблему з прямими механізмами репарації ДНК: вони досить марнотратні. Кожен з незліченних видів хімічних змін підстав вимагає свого власного механізму для корекції. Клітина потребує більш загальних механізмів, здатних виправляти всілякі хімічні пошкодження за допомогою обмеженого набору інструментів. Цій вимозі відповідають механізми висічення ремонту.

Ремонт базового висічення (BER)

Кроки та деякі ключові гравці:

1. видалення пошкодженої основи (за оцінками, відбувається приблизно 20 000 разів на день у кожній клітині нашого організму!) за допомогою ДНК-глікозилази. У нас є щонайменше 8 генів, які кодують різні ДНК-глікозилази, кожен фермент відповідає за виявлення та видалення певного виду пошкодження основи.
2. видалення його дезоксирибози фосфату в хребті, виробляючи розрив. У нас є два гени, які кодують ферменти з цією функцією.
3. заміна правильним нуклеотидом. Це залежить від ДНК-полімерази бета-версії, однієї з принаймні 11 ДНК-полімераз, кодованих нашими генами.
4. перев'язка ламу в пасмо. Відомо два ферменти, які можуть це зробити; обидва вимагають АТФ для забезпечення необхідною енергією.

Ремонт висічення нуклеотидів (NER)

NER відрізняється від BER декількома способами.

• У ньому використовуються різні ферменти.
• Незважаючи на те, що для виправлення може бути лише одна «погана» основа, її нуклеотид видаляється разом з багатьма іншими сусідніми нуклеотидами; тобто NER видаляє великий «пластир» навколо пошкодження.

Кроки та деякі ключові гравці:

1. Пошкодження розпізнається по одному або декільком білковим факторам, які збираються на місці.
2. ДНК розмотується, виробляючи «міхур». Ферментна система, яка робить це, - фактор транскрипції IIH, TFIIH, (який також функціонує в нормальній транскрипції).
3. Розрізи робляться як на стороні 3 ', так і на 5' стороні пошкодженої ділянки, так що тракт, що містить пошкодження, може бути видалений.
4. Свіжий сплеск синтезу ДНК - використовуючи інтактну (протилежну) нитку як шаблон - заповнює правильні нуклеотиди. Відповідальними ДНК-полімеразами позначаються полімераза дельта і епсилон.
5. ДНК-лігаза ковалентно вставляє свіжий шматок в хребет.

Пігментна ксеродерма (XP)

ХР - рідкісне спадкове захворювання людини, яке, крім усього іншого, привертає пацієнта до

• пігментні ураження на ділянках шкіри, що піддаються впливу сонця і
• підвищений рівень захворюваності на рак шкіри.

Виявляється, XP може бути викликаний мутаціями в будь-якому з декількох генів - всі з яких мають ролі в NER. Деякі з них:

• XPA, який кодує білок, який зв'язує пошкоджену ділянку і допомагає зібрати інші білки, необхідні для NER.
• XPB і XPD, які входять до складу TFIIH. Деякі мутації в XPB і XPD також викликають ознаки передчасного старіння. [Посилання]
• XPF, який розрізає хребет на 5' стороні пошкодження
• XPG, який розрізає хребет на стороні 3'.

Транскрипція з'єднана NER

Нуклеотидно-висічення відновлення протікає найбільш швидко в клітині, гени яких активно транскрибуються на ланцюжку ДНК, яка служить шаблоном для транскрипції. Це посилення NER включає XPB, XPD та кілька інших генних продуктів. Генами для двох з них позначаються CSA і CSB (мутації в них викликають спадкове розлад під назвою синдром Кокейна).

Продукт CSB асоціюється в ядрі з РНК-полімеразою II, ферментом, відповідальним за синтез месенджерної РНК (мРНК), забезпечуючи молекулярний зв'язок між транскрипцією та відновленням. Один правдоподібний сценарій: якщо РНК-полімераза II, відстежуючи по шаблону (антисенсу) нитку), стикається з пошкодженою основою, вона може набирати інші білки, наприклад, білки CSA та CSB, щоб швидко виправити, перш ніж перейти до повної транскрипції гена.

Ремонт невідповідності (MMR)

Невідповідність ремонту має справу з виправленням невідповідностей нормальних баз; тобто збоїв у підтримці нормального сполучення бази Watson-Crick (A•T, C•G). Він може заручитися допомогою ферментів, що беруть участь у відновленні висічення основи (BER) та відновлення нуклеотидів (NER), а також за допомогою ферментів, спеціалізованих для цієї функції.

• Розпізнавання невідповідності вимагає декількох різних білків, включаючи один закодований MSH2.
• Вирізання невідповідності також вимагає декількох білків, включаючи один закодований MLH1.

Мутації в будь-якому з цих генів привертають людину до успадкованої форми раку товстої кишки. Таким чином, ці гени кваліфікуються як гени супресорів пухлини.

Як система MMR знає, що є неправильним нуклеотидом?

У кишковій паличці певні аденіни стають метильованими незабаром після синтезу нової нитки ДНК. Система MMR працює швидше, і якщо виявляє невідповідність, то передбачає, що нуклеотид на вже метильованої (батьківської) пасма є правильним і видаляє нуклеотид на свіжосинтезованої дочірньої пасма. Як відбувається таке розпізнавання у ссавців, поки не відомо.

Синтез ремонтного пластиру проводиться за допомогою ДНК-полімерази дельта. Клітини також використовують систему MMR для підвищення вірності рекомбінації; тобто гарантують, що лише гомологічні ділянки двох молекул ДНК з'єднуються, щоб перетинати та рекомбінувати сегменти (наприклад, при мейозі).

Ремонт розривів Strand

Іонізуюче випромінювання та деякі хімічні речовини можуть виробляти як одноланцюгові розриви (SSB s), так і дволанцюгові розриви (DSB s) в магістралі ДНК.

Одножильні розриви (SSB)

Розриви в одному ланцюжку молекули ДНК відновлюються за допомогою тих же ферментних систем, які використовуються в Base-Excision Repair (BER).

Двожильні розриви (DSBs)

Існує два механізми, за допомогою яких клітина намагається відновити повний розрив молекули ДНК:

• Безпосереднє з'єднання зламаних кінців. Для цього потрібні білки, які розпізнають і зв'язуються з оголеними кінцями і зводять їх разом для лігування. Вони вважали за краще бачити деякі додаткові нуклеотиди, але можуть протікати без них, тому цей тип приєднання також називають негомологічним кінцевим з'єднанням (NHEJ). Білок під назвою Ku необхідний для NHEJ. Ку - гетеродимер субодиниць Ку70 і Ку80. Помилки при прямому з'єднанні можуть бути причиною різних транслокацій, які пов'язані з раковими захворюваннями. Деякі приклади включають лімфому Беркітта, філадельфійську хромосому при хронічному мієлолейкозі (ХМЛ) та В-клітинний лейкоз.
• Гомологічна рекомбінація (також відома як гомологічне відновлення - HDR). Тут зламані кінці ремонтуються за допомогою інформації про інтактний сестринський хроматид (наявний в G ₂ після дублювання хромосом), або на гомологічну хромосому (в G ₁; тобто перед кожною хромосомою був продубльований). Це вимагає пошуку навколо в ядрі для гомолога - завдання досить невизначене, що клітини G ₁ зазвичай вважають за краще виправляти свої DSBs за допомогою NHEJ. або на
• та ж хромосома, якщо на хромосомі, орієнтованої в протилежних напрямках (голова до голови або спина до спини) є повторювані копії гена.
• Два білки, що використовуються в гомологічній рекомбінації, кодуються генами BRCA1 і BRCA2. Успадковані мутації в цих генах привертають жінок до раку молочної залози і яєчників.

Генерація різноманітності антитіл

Деякі з тих самих ферментів, що використовуються для відновлення DSBs шляхом прямого приєднання, також використовуються для розриву та повторного збирання генних сегментів, які використовуються для створення

• області змінних антитіл; тобто для досягнення V (D) J приєднання — (миші, чиї гени Ku80 були вибиті, не можуть цього зробити);
• різні класи антитіл; тобто здійснити перемикання класів

Мейоз також включає DSBs

Рекомбінація між гомологічними хромосомами при мейозі I також передбачає утворення ДСБ і їх відновлення. Тому не дивно, що в цьому процесі використовуються ті ж ферменти.

Мейоз I з вирівнюванням гомологічних послідовностей забезпечує механізм відновлення пошкодженої ДНК; тобто мутацій. насправді багато біологів вважають, що основна функція сексу полягає в забезпеченні цього механізму підтримки цілісності генома.

Однак більшість генів Y-хромосоми людини не мають аналога по Х-хромосомі і, отже, не можуть скористатися цим механізмом відновлення. Вони, здається, вирішують цю проблему, маючи кілька копій одного і того ж гена - орієнтованих в протилежних напрямках. Циклічне втручання ДНК об'єднує дублікати і дозволяє відновити за допомогою гомологічної рекомбінації.

Перетворення генів

Якщо послідовність, яка використовується як шаблон для відновлення гена шляхом гомологічної рекомбінації, дещо відрізняється від гена, який потребує відновлення; тобто є алелем, відремонтований ген придбає донорську послідовність. Ця незворотна передача генетичної інформації називається генною конверсією.

Донором нової послідовності генів можуть бути:

• гомологічна хромосома (під час мейозу)
• сестринський хроматид (також під час мейозу)
• дублікат гена на тій же хромосомі (під час мітозу)

Перетворення генів під час мейозу змінює нормальні менделінові співвідношення. Зазвичай мейоз у гетерозиготного (A, a) батька виробляє гамети або спори у співвідношенні 1:1; наприклад, 50% A; 50% a. Однак якщо відбулася конверсія генів, з'являться інші співвідношення. Якщо, наприклад, алель А дарує свою послідовність, коли він відновлює пошкоджений алель, відремонтований ген стане A, а співвідношення становитиме 75% A; 25% a.

Хіміотерапія раку

• Відмінною рисою всіх видів раку є безперервне поділ клітин.
• Кожен поділ вимагає обох
  • реплікація ДНК клітини (в S-фазі) і
  • транскрипція і переклад багатьох генів, необхідних для подальшого зростання.
• Отже, будь-яка хімічна речовина, яка пошкоджує ДНК, має потенціал гальмувати поширення раку.
• Багато (але не всі) препарати, що використовуються для терапії раку, роблять свою роботу, пошкоджуючи ДНК.

У таблиці перераховані (за торговою назвою, а також загальною назвою) деякі протипухлинні препарати, які спеціально націлені на ДНК.

6-меркаптопурин	Пуринетол®	пуриновий аналог. Один ефект: замінники G, що індукують абортивний MMR і розриви ниток
Гемцитабін	Гемзар®	аналог піримідину замінники C блокують подовження нитки
Циклофосфамід	Цитоксан®	алкілуючі агенти; утворюють міжнитьові і/або внутрішньожильні зшивання
Мелфалан	Алькеран®
Бусульфан	Майлеран®
хлорамбуцил	Лейкеран®
Мітоміцин	Мутаміцин®
цисплатин	Платинол®	формує зшивання
Блеоміцин	Бленоксан®	розрізає нитки ДНК між GT або GC
Іринотекан	Камптосар®	пригнічують належне функціонування ферментів (топоізомераз), необхідних для розмотування ДНК для реплікації та транскрипції
Мітоксантрон	Новантрон®
доксорубіцин	Адріаміцин®
Дактиноміцин	Космеген®	вставки в подвійну спіраль, що перешкоджають її розмотуванню

У хворого на рак є багато інших типів клітин, які також швидко розмножуються, наприклад, клітини ендотелію кишечника, кісткового мозку та волосяних фолікулів. Протиракові препарати також пошкоджують їх — виробляючи багато неприємних побічних ефектів «хіміотерапії». Агенти, що пошкоджують ДНК, самі по собі є канцерогенними, а хіміотерапія становить значний ризик створення нового раку, часто лейкемії.