5.3: Кількісне визначення концентрації білка

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7516

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Огляд: Закон Пива-Ламберта

журнал (1/Т) = ε сл = А
Т = 1/10 ^А

Значення для ε і l

Довжина шляху l зазвичай знаходиться в одиницях см. (Примітка: більшість спектрофотометрів призначені для прийому кюветів шириною 1 см)
Молярний коефіцієнт екстинкції ε має одиниці М ^-1 см ^-1 і є константою пропорційності, яка пов'язує поглинання молярних розчинів
Коефіцієнт масового загасання ε ^1% відноситься до поглинання 1% по масі розчину. Як правило, це стосується водного розчину, який ми можемо прийняти, щоб мати щільність 1000 г/л. 1% за масою водного розчину, отже, буде стосуватися розчинення 10 г/л, або 10 мг/мл розчину молекули, що цікавить.
Оскільки поглинання молекули є функцією довжини хвилі (тобто поглинання не дорівнює для кожної довжини хвилі), коефіцієнт екстинкції також повинен посилатися на довжину хвилі. Зазвичай це робиться за допомогою нижнього індексу:

ε ^1% _280нм = 14,5 г ^-1 л см ^-1

· У цьому випадку розчин молекули 10 мг/мл матиме показання поглинання 14,5 (безрозмірні одиниці) при l = 280nm (поглинання на інших довжині хвиль може бути невідомим). Одиницями концентрації є г/л, при цьому e матиме розміри g ^-1 L см ^-1.

Чому важливо вміти кількісно визначити концентрацію білка у зразку?

Важливим застосуванням «Біотехнології» є виробництво білків як комерційних продуктів. Такі продукти можуть мати фармацевтичне застосування (наприклад, інсулін, гормон росту людини, активатор плазміногену тканини, еритропоетин, фактор згортання крові VIII.), промислове застосування (наприклад, субтилізін (фермент у миючих засобах), 2,5-дикето-D-глюконат-редуктаза (фермент у виробництві вітаміну С), як матеріали (наприклад, білок шовку в текстилі, білок адгезії барнакл як клей). У цих випадках існують різні аспекти успішного виробництва, які вимагають кількісного визначення:

Скільки протеїну можна виробляти (тобто яка ефективність виробництва)?
Наскільки чистий білок, який виробляється (промислове застосування може вимагати 90% чистого, фармацевтичне застосування може вимагати 99,999% чистого)

Такі білки можуть бути виділені з природних джерел (наприклад, фактор згортання крові VIII може бути витягнутий з крові людини), або вони можуть бути вироблені рекомбінантно (наприклад, бактеріальні клітини кишкової палички можуть бути генетично сконструйовані для виробництва людського гормону росту). В обох випадках може знадобитися очищення білка за допомогою серії етапів фракціонування. Більш детально про такі етапи фракціонування ми розглянемо в більш пізній лекції, але загальна ідея полягає в тому, що гетерогенна суміш молекул може бути фракціонована на основі деяких фізичних властивостей молекул. Нижче наведені властивості, які можуть бути використані для фракціонування гетерогенної суміші біомолекул:

Молекулярна маса (тобто «великі» молекули можуть бути відокремлені від «малих» молекул)
pKA (тобто «кислі» молекули можуть бути відокремлені від «основних» молекул)
Гідрофобність (тобто неполярні молекули можуть бути відокремлені від полярних молекул)

Для таких етапів фракціонування за участю білків нам потрібно стежити за тим, скільки забруднюючих білків пішло в одну фракцію і скільки потрібного нам білка пішло в іншу фракцію. Хоча деталі дещо складніші, ніж цей простий опис, важливо вміти кількісно оцінювати концентрацію білка, щоб мати можливість ефективно очистити білок, що цікавить.

Після того, як білок чистий, це може становити значний економічний інтерес, щоб мати можливість кількісно оцінити врожайність (і, отже, мати можливість визначити, скільки коштує виробляти задану масу білка). Наприклад, єдиним джерелом для людського гормону росту (для лікування невеликого зросту) використовувався, щоб витягти його з людського гіпофіза, зібрані з мозку кадавр. Досить сказати, що це зробило білок надзвичайно дорогим. Крім того, ізоляція з тканин людини означала, що зразок також може бути потенційно заражений хвороботворними мікроорганізмами людини (гепатит, CJD, СНІД тощо). З появою генної інженерії виробництво людського гормону росту бактеріальними клітинами (тобто кишкова паличка) означало, що відносні великі кількості можуть бути вироблені набагато дешевше (і без загрози патогенів людини).

Чому б просто не зважити білок?

Більшість зразків, як правило, кількості міліграмів або навіть мікрограмів, а не грамів, і, таким чином, важко перенести і виміряти такі невеликі кількості
Вода присутня в білках, і видалити всю воду вкрай складно (деякі молекули води водню надзвичайно щільно зв'язуються з білками). Таким чином, вимірювання маси включало б деякі води і збільшило б видиму масу білка

Спектри поглинання біологічних молекул

Білки

Білки не поглинаються на видимій довжині хвилі, якщо вони не мають протезної групи (наприклад, Fe ²⁺) або неприродної амінокислоти. Однак амінокислоти триптофан, тирозин і цистеїн поглинають світло на довжині хвилі УФ:

Знімок екрана (395) .png

Малюнок 5.3.1: Поглинання триптофану

Триптофан має пік поглинання при 280 нм в УФ-діапазоні.
Це корисна довжина хвилі для кількісного поглинання триптофану.
Оскільки абсорбція пропорційна концентрації, це корисний спосіб кількісного визначення концентрації білка (для білків, що містять Trp)

Нуклеїнові кислоти

Ароматичні кільця в основах нуклеїнових кислот також поглинають в УФ-діапазоні:

Знімок екрана (396) .png

Малюнок 5.3.2: Вологе поглинання

Кожна основа ДНК та РНК має дещо інший спектр поглинання.
260 або 280 нм - це зазвичай корисна довжина хвилі для моніторингу концентрації нуклеїнових кислот

Зверніть увагу, що зразки нуклеїнових кислот і білків можуть як поглинати при 280 нм, тому зразки біологічних молекул повинні бути чистими, щоб кількісно використовувати УФ-абсорбційну спектроскопію (будь-які забруднюючі нуклеїнові кислоти в зразку білка збільшать видиме поглинання, так само для забруднюючі білки в зразку нуклеїнової кислоти).

Важливі аспекти кількісної оцінки білків за допомогою поглинання УФ

Якщо білок містить залишки Trp, Tyr або Cys, він поглинається в УФ. Якщо він не містить цих амінокислот, він не поглинає УФ-світло, і ми не можемо кількісно оцінити його за допомогою цього методу
Множинні залишки Trp, Tyr або Cys сприятимуть коефіцієнту екстинкції для білка. Таким чином, нам потрібно знати, скільки цих залишків присутня в білку, щоб знати правильний коефіцієнт зникнення.
Нуклеїнові кислоти (ДНК, РНК) забруднювач також поглинає ультрафіолетове світло, як і інші білки із залишками Trp, Tyr і Cys. Таким чином, зразок повинен бути ЧИСТИМ, щоб використовувати поглинання УФ для кількісної оцінки білка

Молярні коефіцієнти екстинкції амінокислот Trp, Tyr і Cys:

Амінокислота	Е _{280 нм} (М ^-1 см ^-1)
Трп	5690
Тир	1280
Cys	120

Приклад 5.3.1: Бичачий інсулін

Бичачий інсулін містить 4 залишки Тиру, 6 залишків Cys і 0 залишків Trp. Ми можемо визначити очікуваний молярний коефіцієнт екстинкції при 280nm, E _280nm, шляхом наступного розрахунку:

Е _280нм = (0) (5690) + (4) (1280) + (6) (120)

Е _280нм = 5840 М ^-1 см ^-1

Таким чином, 1,0 М розчин чистого бичачого інсуліну дасть поглинання 5,840 при 280 нм (очевидно, його потрібно було б значно розбавити, щоб його точно зчитували).

Корисний вираз, що стосується параметрів Е, концентрації (С) та А, походять від закону Беера-Ламберта (припускаючи довжину шляху 1 см):

А/Е = С

Наприклад, якщо зразок бичачого інсуліну спостерігався, щоб дати поглинання при 280 нм 0,745, ми могли б обчислити концентрацію, щоб бути:

0,745/5840 М ^-1 см ^-1 = С

C = 1,28 х 10 ^-4 М (примітка: см ^-1 випадає з довжиною шляху 1 см)

Слід зазначити, що для УФ-спектрофотометрії потрібна дейтерієва лампа, а також кварцові кювети (так як скло поглинає ультрафіолетове світло)

Колориметричні (хромогенні) методи визначення концентрації білка

Хромо означає колір, а генезис означає створення, тому хромогенний означає «створення кольору». Колір означає колір (duh...), а метричний означає для вимірювання, тому колориметричний - це «виміряти колір». Обидва терміни відносяться до одного і того ж в даному випадку - ми можемо модифікувати зразок білка відповідними реагентами таким чином, щоб виробити колірну реакцію (у видимому спектрі) і виміряти концентрацію білка за допомогою спектрофотометра VIS. Перевагами є:

Дешева лампа! (вольфрамова лампочка проти дейтерію для УФ)
Дешева кювета! (дешеве скло або пластик проти кварцу)
Чи не забруднює абсорбцію білків або нуклеїнових кислот! (відсутність поглинання в спектрі VIS)

Ми розглянемо три методи: Біурет, Лоурі і Бредфорд методи колориметричного визначення білків.

Бюрет

Вважається, що в умовах високого рН (лужні) іон міді II (Cu ²⁺) утворює комплекс з пептидними азотами білків:

Знімок екрана (397) .png

Малюнок 5.3.3: Cu ²⁺ комплекс

Цей комплекс поглинає світло на 550нм і володіє наступними корисними властивостями:

Це залежить принаймні від дипептидної структури (див. Вище), таким чином, забруднюючі амінокислоти не сприятимуть поглинанню 550 нм
Зв'язування залежить від азоту пептидної магістралі, а не від функціональної групи бічного ланцюга. Таким чином, прив'язка не залежить від послідовності.
Нуклеїнові кислоти не заважають, оскільки вони не поділяють структуру пептидного хребта
Однак аміак і певні аміни можуть заважати. Таким чином, солі сульфату амонію, і загальний біологічний буфер TRIS (трис гідроксиметиламіноетан) забезпечать хибнопозитивний результат і не можуть бути присутніми в зразку
Також абсорбція відносно слабка, таким чином, метод кілька нечутливий і вимагає відносно високої концентрації білка

Лоурі

Метод Лоурі є модифікацією методу Біурета. Після обробки міддю II білок обробляють фосфомолібдовольфраматной змішаними кислотами (кислі сполуки іонів молібдену і вольфраму). Ці кислоти відомі як реагент Фолін-Чокальтеу (або просто Фолін). Реагент Фолін додається в лужних умовах, а реагент Фолін згодом відновлюється іонами міді, а також бічними ланцюгами Tyr, Trp та полярних амінокислот. Продукт цієї реакції - гетерополімолібденовий синій, який сильно поглинається при 750нм. Цей аналіз має такі властивості:

Більш чутливий, ніж аналіз Biuret (може виявити нижчі концентрації білка)
Дещо залежить від амінокислотного складу (тобто відносних концентрацій Tyr, Trp і полярних амінокислот)
Реакція абсорбції лінійно залежить від концентрації білка, але тільки при низьких концентраціях білка (тобто стандартна крива і аналіз повинні виконуватися при низькому режимі концентрації).
Чутливі до забруднень як при методі Біурета, так і до інших, пов'язаних з реагентом Фоліна і окислювально-відновними реакціями.
Більш критично важливий для часу та точності людини, яка робить аналіз

Бредфорд

Барвник, відомий як Coomassie Brilliant Blue, був розроблений текстильною промисловістю. Було помічено, що фарбують шкіру, а також текстиль. Таким чином, цей барвник (який нормально поглинається при 465 нм), як відомо, зв'язується з білками і сильно поглинається при 595 нм. Барвник утворює широкий спектр сильних, але нековалентних взаємодій, включаючи взаємодію донора та акцептора водню, а також гідрофобні (неполярні) взаємодії.

Знімок екрана (398) .png

Малюнок 5.3.4: Блискуча синя палітурка Кумассі

Метод досить простий: один етап, при якому барвник додається в розчин білка в кислих умовах, а потім зчитується поглинання на рівні 595 нм. Однак метод має такі властивості:

Відповідь, як правило, не залежить від амінокислотного складу.
Аналіз чутливий, але дещо нелінійний. Таким чином, завжди повинна виконуватися стандартна крива (використовуючи відомі концентрації чистого білка)
Барвник забарвлює майже все, включаючи кювети, підлоги, стільниці. Це може бути справжній безлад, якщо розлитий (я знаю це з особистого досвіду). А оскільки це текстильний барвник, якщо ви потрапите його на одяг, вам потрібно буде навчитися подобатися синім горошкам.