Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

4.2: Фаг М13

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    7523

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Бактеріофаг, відомий як «М13», становить основу систем клонування, призначених для легкого введення мутацій в гени, вставлені в геном фага. Він також був використаний у різних методологіях «відображення фагів» та «комбінаторних» бібліотеках ДНК та пептидів.

    Інфекція і реплікація M13

    M13 - це нитчастий бактеріофаг, який заражає господаря кишкової палички. Геном М13 має такі характеристики:

    • Кругова одноланцюгова ДНК
    • 6400 базових пар довгих
    • Коди геному загалом 10 генів (названі за допомогою римських цифр від I до X)

    Знімок екрана (348) .png

    Малюнок 4.2.1: Геном М13

    • Коди гена VIII для основного структурного білка частинок бактеріофагів
    • Коди гена III для білка мінорної оболонки

    Знімок екрана (349) .png

    Малюнок 4.2.2: Ген III і ген VIII

    • Білок гена VIII утворює трубчастий масив приблизно 2700 однакових субодиниць, що оточують вірусний геном
    • Приблизно п'ять-вісім копій білка гена III розташовані на кінцях нитчастого фага (тобто геном плюс ген VIII збірка)
    • Дозволяє зв'язуватися з бактеріальним «статевим» пілусом
      • Пілус - це бактеріальна поверхнева структура кишкової палички, яка містить екстрахромосомний елемент «F фактор».

    Інфекція

    • Одножильний геном (позначений «+» ниткою), прикріплений до пілусу, потрапляє в клітину-господаря
      • Білок основної оболонки (ген VIII) позбавлений
      • Мінорний білок оболонки (ген III) залишається прикріпленим
    • Компоненти хоста перетворюють однонитковий (+) геном у подвійну багатониткову кругову ДНК (називається реплікативною або «RF» формою)
    • починається транскрипція
      • Серія промоутерів
        • Забезпечує градієнт транскрипції, такий, що ген, найближчий до двох термінаторів транскрипції, транскрибуються найбільш
      • Два термінатора
        • Один в кінці гена VIII
        • Один в кінці гена IV
      • Транскрипція всіх 10 генів протікає в одному напрямку

    Ампліфікація вірусного генома

    • Білок гена II вводить «нік» в (+) нитку
    • Пол I подовжує (+) пасмо, використовуючи зміщення пасма (і пасмо '-' як шаблон)
    • Після однієї поїздки навколо генома білок гена II знову збивається, щоб випустити завершений (лінійний) геном «+»
      • Лінійний (+) геном циркуляризується
    • Протягом перших 15-20 хвилин реплікації ДНК нитки потомства (+) перетворюються в дволанцюгову (РФ) форму
      • Вони служать додатковими шаблонами для подальшої транскрипції
    • Ген V білок накопичується
      • Це одноцепочечной ДНК зв'язуючий білок
      • Запобігає перетворенню однієї (+) нитки в радіочастотну форму
    • Тепер отримайте накопичення кругової однониткової (+) ДНК (геном М13)

    Знімок екрана (350) .png

    Малюнок 4.2.3: Ампліфікація генома

    Фагове фагове пакування

    • Основний білок оболонки (ген VIII) присутній в мембрані кишкової палички
    • Геном M13 (+), покритий ss зв'язуючим білком - білком гена V, переміщається на клітинну мембрану
    • Білок гена V позбавлений, а основний білок оболонки (ген VIII) охоплює фагову ДНК, коли вона видавлюється
      • Тому процес упаковки не пов'язаний з будь-яким обмеженням розміру генома М13.
      • Довжина ниткоподібного фага визначається розмірами ДНК в геномі
      • Вставки розміром до 42 Кб були введені в геном М13 та упаковані (розмір геному 7x)
    • ~ 8 копій білка гена III прикріплені в кінці екструдованого генома

    Розробка М13 в вектор клонування

    M13 був розроблений в корисний вектор клонування, вставивши в геном наступні елементи:

    • ген для білка лак-репресора (lac I), що дозволяє регулювати промотор лаку
    • оператор-проксимальна область гена lac Z (для забезпечення a -комплементації у господаря з операторно-проксимальною делецією гена lac Z).
    • промотор лаку вище за течією гена Lac Z
    • полілінкер (багаторазовий сайт клонування) область вставив кілька кодонів в ген lac Z

    Скріншот (351) .png

    Малюнок 4.2.4: Вставки в геном

    • Вектори були названі відповідно до конкретної області полілайнера, яку вони містили
    • Вектори, як правило, будувалися парами, з полілінкерними областями в протилежних орієнтаціях.

    Скріншот (352) .png

    Малюнок 4.2.5: P полілінкерні області

    Клонування в вектори M13mP

    • РЧ (подвійна багатожильна) форма фага М13 може бути ізольована і оброблена так само, як і будь-яка інша плазміда
    • Область полілінкера може бути «відкрита» за допомогою рестрикційних ендонуклеаз, придатних для прийняття фрагмента, що цікавить
    • Фрагмент лігується в область plink
    • Наявність зворотно-орієнтованих plink (наприклад, mp18, mp19) означає, що вставлені фрагменти з недоповнюючими кінцями можуть бути вставлені в будь-якій орієнтації

    Одножильні форми фага

    Здатність виділяти однониткову форму фага має переваги як в секвенуванні, так і в мутагенезі.

    • Одножильний шаблон ДНК можна прочитати далі, ніж подвійний багатожильний шаблон

    Розроблено ефективний метод мутагенезу (метод «Кункеля») з використанням однониткової форми фага.

    • Вектор M13mP з вставкою вперше вирощується в мутантному E. coli господаря (наприклад, CJ236), який іноді включав урацил в ДНК замість тимідину.
      • Кишкова паличка в нормі синтезує фермент (урацил-N-глікозидазу), який видаляє залишки урацилу в ДНК. Однак у легких штамів урацил не видаляється
      • Рівень неправильної інкорпорації урацилу в ДНК підвищується у штамів, які мають дефіцит dutPase. Цей фермент перетворює dUTP в dUDP, і, отже, в дут-штамах рівні dUtP підвищені і підсилюють дезінкорпорацію dUTP в ДНК господаря.
      • Штам E. coli CJ236 має генотип, який включає в себе dut-/ung- особливості
    • Мутагенна грунтовка буде відпалена до цього шаблону однієї нитки (наприклад, для створення точкової мутації)
    • Грунтовка розширюється за допомогою чотирьох dNtP, і лігується для отримання дуплексної ДНК
    • Дуплексна ДНК вставляється в іншу кишкову паличку господаря (наприклад, JM101), яка розпізнає і висікає (деградує) урацил, що містить ДНК (тобто штам, який є ung+)
    • Батьківська (дикого типу) нитка переважно деградується, а мутагенна нитка тиражується.
    • Фагове потомство, як правило, має високу частоту (80-90%) бажаної мутації.

    Скріншот (353) .png

    Малюнок 4.2.6: Метод Кункеля